צינור לאפיון מומי לב מבניים בעכבר העוברי
Summary
מאמר זה מפרט את שיטות האבחון של מחלת לב מולדת (CHD) באמצעות אקוקרדיוגרפיה עוברית, נקרופסיה, ולכידת תמונה פלואורסצנטית אפיסקופית (EFIC) באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אפיסקופי (ECM) ואחריו שחזור תלת ממדי (3D).
Abstract
מחלות לב מולדות (CHDs) הן הגורמים העיקריים למוות תינוקות בארצות הברית. בשנות השמונים ולפני כן, רוב החולים עם CHD בינוני או חמור מתו לפני הבגרות, עם התמותה המקסימלית בשבוע הראשון לחיים. התקדמות יוצאת דופן בטכניקות כירורגיות, גישות אבחון וניהול רפואי הובילו לשיפור ניכר בתוצאות. כדי לענות על הצרכים המחקריים הקריטיים של הבנת מומי לב מולדים, מודלים של מורין סיפקו פלטפורמת מחקר אידיאלית, מכיוון שיש להם אנטומיה דומה מאוד לבני אדם ושיעורי הריון קצרים. השילוב של הנדסה גנטית עם כלי פנוטיפ בעלי תפוקה גבוהה איפשר שכפול ואבחון של מומי לב מבניים כדי להבהיר עוד יותר את המסלולים המולקולריים שמאחורי CHDs. השימוש באקוקרדיוגרפיה עוברית לא פולשנית כדי לסנן את הפנוטיפים הלבביים במודלים של עכברים יחד עם הנאמנות הגבוהה של לכידת תמונה פלואורסצנטית אפיסקופית (EFIC) באמצעות היסטופתולוגיה של מיקרוסקופ קונפוקלי אפיסקופי (ECM) עם שחזורים תלת ממדיים (3D) מאפשרים מבט מפורט על האנטומיה של מומי לב מולדים שונים. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה מלאה של שיטות אלה כדי לקבל אבחנה מדויקת של מומי לב מולדים. יישום פרוטוקול פנוטיפ זה על אורגניזמים מודל יאפשר אבחון מדויק של CHD, ויניב תובנות לגבי המנגנונים של CHD. זיהוי המנגנונים הבסיסיים של CHD מספק הזדמנויות לטיפולים והתערבויות פוטנציאליים.
Introduction
מחלות לב מולדות (CHDs) הן המומים המולדים הנפוצים ביותר בילוד 1,2, המשפיעות על כ-0.8%-1.7% מהיילודים וגורמות לתמותה ותחלואה משמעותית בילוד3. אטיולוגיה גנטית מסומנת בחוזקה עם CHDs 4,5. מודלים של עכברים מהונדסים גנטית שימשו באופן נרחב כדי להבין את המורכבות של CHDs ואת המנגנונים הגורמים להם עקב עכברים בעלי לבבות בעלי ארבעה חדרים ורצפי DNA התפתחותיים לבביים דומים בעכברים ובעוברים אנושיים6. זיהוי הפנוטיפ של מוטציות העכבר הוא הצעד הראשון הבסיסי באפיון תפקודו של גן היעד. מודלים עכבריים המבטאים השפעות מינון גנים, שבהם מוטציה גנטית אחת יכולה לגרום לספקטרום של פגמים לבביים המחקים CHDs אנושיים, חשובים להבנת המורכבות של CHDs והמנגנונים הגורמים להם.
מאמר זה מתאר צינור לאפיון פנוטיפים לבביים במודלים של עכברים. השיטות המיושמות משתמשות באקו לב עוברי 7, ואחריו נקרופסי והיסטופתולוגיה ECM7,8, שיכולים להציג את האנטומיה המפורטת של התפתחות פנוטיפים לבביים. אקו לב עוברי הוא שיטה לא פולשנית המאפשרת הדמיה ישירה של עוברים מרובים ברזולוציית הדמיה סבירה. בנוסף, אקו לב עוברי מספק קביעה מהירה של המספר הכולל של עוברים בהמלטה, שלבי התפתחותם, ואת הכיוון והמיקום היחסי בקרן הרחם. באמצעות זרימת דופלר/צבע ספקטרלית, ניתן לזהות עוברים חריגים על סמך המבנה, ההפרעה ההמודינמית, הגבלת הגדילה או התפתחות ההידרופים. מכיוון שמחקר אקו לב עוברי הוא טכניקה לא פולשנית, ניתן להשתמש בו כדי לסרוק מספר ימים ולצפות בשינויים בהמודינמיקה או במורפולוגיה של הלב. השגת הדמיה איכותית של אקו לב עוברי דורשת תרגול ומיומנות, שכן מומי לב ספציפיים עלולים להחמיץ בשל חוסר ניסיון וידע. בגלל זה, ניתוח סופי יותר של מורפולוגיה הלב ניתן להשיג באמצעות שילוב של נקרופסי היסטופתולוגיה ECM. נקרופסי מספק הדמיה ישירה של מבנה הקשת, היחסים היחסיים של אבי העורקים ועורק הריאה, גודל החדרים והאטריה, מיקום הלב ביחס לחזה והמבנים הברונכופולמונריים. עם זאת, תכונות פנים כגון שסתומי הלב ועובי הדופן עשויים להיות קשים להערכה באמצעות נקרופסי בלבד. לכן, היסטופתולוגיה ECM מומלץ לאבחנה חד משמעית. היסטופתולוגיה ECM היא טכניקת הדמיה ברזולוציה גבוהה המאפשרת שחזור דו-ממדי ותלת-ממדי של מחסנית התמונות9. תמונות אלה מתקבלות באמצעות הדמיה פלואורסצנטית אפיסקופית סדרתית של דגימה משובצת פרפין כפי שהיא חתך דק במרווח קבוע על ידי מיקרוטום אוטומטי. שלא כמו היסטולוגיה קלאסית, תמונות נלכדות כמקטע לפני שהוא נחתך מהבלוק כך שכל התמונות נלכדות באותה מסגרת התייחסות. מסיבה זו, מחסנית התמונות הדו-ממדית המיוצרת על ידי היסטופתולוגיה ECM עשויה להיות משוחזרת בקלות ובאמינות בשלושה ממדים. הדבר נעשה באמצעות מציג DICOM, המאפשר הדמיה תלת ממדית של התמונות בשלושת המישורים האנטומיים: קורונלי, קשת ורוחבי. משחזורים תלת-ממדיים ברזולוציה גבוהה אלה, ניתן לבצע אבחנה לבבית סופית. היישום של שלוש שיטות הדמיה שונות אלה, בנפרד או בשילוב, יכול לספק אפיון מדויק של מומי לב מבניים בעוברי עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
עכברים מהונדסים גנטית שימשו להבנת הפתומנגנונים של מומי לב מולדים. הפרוטוקולים שאנו מספקים במחקר זה מנסים לייעל ולתקנן את תהליך הערכת מומי הלב של העובר. עם זאת, ישנם שלבים קריטיים שיש לציין במהלך הפרוטוקול. עוברי עכבר גדלים באופן משמעותי במהלך כל יום של הריון, ואת הזמן הנכון לקצור עכבר ניתן…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ללא.
Materials
| 1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
| 10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
| 50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
| 6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
| Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
| Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
| Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
| Embedding molds | Sakura | 4133 | |
| Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
| Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
| Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
| Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
| Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
| Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
| Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
| Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
| Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
| Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |
References
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), e20593 (2020).
- vander Linde, D., et al. Birth prevalence of congenital heart disease worldwide: a systematic review and meta-analysis). Journal of the American College of Cardiology. 58 (21), 2241-2247 (2011).
- Yang, Q., et al. Racial differences in infant mortality attributable to birth defects in the United States. Birth Defects Research. Part A, Clinical and Molecular Teratology. 76 (10), 706-713 (1989).
- Patel, A., et al. Prevalence of noncardiac and genetic abnormalities in neonates undergoing cardiac operations: Analysis of the society of thoracic surgeons congenital heart surgery database. The Annals of Thoracic Surgery. 102 (5), 1607-1614 (2016).
- Pierpont, M. E., et al. Genetic basis for congenital heart disease: Revisited: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation. 138 (21), e653-e711 (2018).
- Krishnan, A., et al. A detailed comparison of mouse and human cardiac development. Pediatric Research. 76 (6), 500-507 (2014).
- Liu, X., et al. Interrogating congenital heart defects with noninvasive fetal echocardiography in a mouse forward genetic screen. Circulation. Cardiovascular Imaging. 7 (1), 31-42 (2014).
- Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 99 (2), 93-105 (2013).
- Tsuchiya, M., Yamada, S. High-resolution histological 3D-imaging: episcopic fluorescence image capture is widely applied for experimental animals. Congenital Anomalies (Kyoto. 54 (4), 250-251 (2014).
- Yu, Q., Tian Leatherbury, ., Lo, X., W, C. Cardiovascular assessment of fetal mice by in utero echocardiography). Ultrasound in Medicine and Biology. 34, 741-752 (2008).
- Rosenthal, J., et al. Rapid high resolution three-dimensional reconstruction of embryos with episcopic fluorescence image capture. Birth Defects Research. Part C, Embryo Today: Review. 72 (3), 213-223 (2004).
- Weninger, W. J., Mohun, T. Phenotyping transgenic embryos: a rapid 3-D screening method based on episcopic fluorescence image capturing. Nature Genetics. 30 (1), 59-65 (2002).
