Denna artikel beskriver murina medfödda hjärtsjukdomar (CHD) diagnostiska metoder med fetal ekokardiografi, obduktion och episkopisk fluorescensbildtagning (EFIC) med episkopisk konfokalmikroskopi (ECM) följt av tredimensionell (3D) rekonstruktion.
Medfödda hjärtsjukdomar (CHD) är viktiga orsaker till spädbarnsdöd i USA. På 1980-talet och tidigare dog de flesta patienter med måttlig eller svår kranskärlssjukdom före vuxen ålder, med maximal dödlighet under den första levnadsveckan. Anmärkningsvärda framsteg inom kirurgiska tekniker, diagnostiska metoder och medicinsk hantering har lett till markanta förbättringar av resultaten. För att tillgodose de kritiska forskningsbehoven för att förstå medfödda hjärtfel har murina modeller gett en idealisk forskningsplattform, eftersom de har mycket liknande hjärtanatomi som människor och korta graviditetshastigheter. Kombinationen av genteknik med fenotypningsverktyg med hög kapacitet har möjliggjort replikation och diagnos av strukturella hjärtfel för att ytterligare belysa de molekylära vägarna bakom CHD. Användningen av icke-invasiv fetal ekokardiografi för att screena hjärtfenotyperna i musmodeller i kombination med den höga troheten hos episkopisk fluorescensbildtagning (EFIC) med hjälp av episkopisk konfokalmikroskopi (ECM) histopatologi med tredimensionella (3D) rekonstruktioner möjliggör en detaljerad bild av anatomin hos olika medfödda hjärtfel. Detta protokoll beskriver ett komplett arbetsflöde av dessa metoder för att få en korrekt diagnos av murina medfödda hjärtfel. Att tillämpa detta fenotypningsprotokoll på modellorganismer kommer att möjliggöra noggrann CHD-diagnos, vilket ger insikter i mekanismerna för CHD. Att identifiera de underliggande mekanismerna för CHD ger möjligheter till potentiella terapier och interventioner.
Medfödda hjärtsjukdomar (CHD) är den vanligaste neonatala fosterskadan 1,2, som påverkar cirka 0,8% –1,7% av nyfödda och resulterar i signifikant neonatal dödlighet och sjuklighet3. En genetisk etiologi är starkt indicerad med CHD 4,5. Genmodifierade musmodeller har använts i stor utsträckning för att förstå komplexiteten hos CHD och de mekanismer som orsakar dem på grund av att mössen har fyrkammarhjärtan och jämförbara hjärtutvecklings-DNA-sekvenser hos mus och mänskliga foster6. Att identifiera fenotypen hos musmutanterna är det grundläggande första steget i att karakterisera funktionen hos den riktade genen. Musmodeller som uttrycker gendoseringseffekter, där en enda genetisk mutation kan resultera i ett spektrum av hjärtfel som efterliknar mänskliga CHD, är viktiga för att förstå komplexiteten hos CHD och de mekanismer som orsakar dem.
Den här artikeln beskriver en pipeline för att karakterisera hjärtfenotyper i musmodeller. De tillämpade metoderna använder fetalt ekokardiogram 7, följt av obduktion och ECM-histopatologi 7,8, som kan visa den detaljerade anatomin för att utveckla murina hjärtfenotyper. Ett fetalt ekokardiogram är en icke-invasiv modalitet som möjliggör direkt visualisering av flera embryon med rimlig bildupplösning. Dessutom ger ett fetalt ekokardiogram en snabb bestämning av det totala antalet embryon i en kull, deras utvecklingsstadier och den relativa orienteringen och platsen i livmoderhornet. Med hjälp av ett spektralt doppler/färgflöde kan onormala embryon identifieras baserat på strukturen, den hemodynamiska störningen, tillväxtbegränsningen eller utvecklingen av hydrops. Eftersom en fosterekokardiogramstudie är en icke-invasiv teknik kan den användas för att skanna på flera dagar och för att observera förändringarna i hemodynamik eller hjärtmorfologi. Att få högkvalitativ avbildning av fostrets ekokardiogram kräver övning och skicklighet, eftersom specifika hjärtfel kan missas på grund av brist på erfarenhet och kunskap. På grund av detta kan en mer definitiv analys av hjärtmorfologi erhållas genom en kombination av obduktion och ECM-histopatologi. Obduktion ger direkt visualisering av bågstrukturen, de relativa relationerna mellan aorta och lungartär, storleken på ventriklerna och atrierna, hjärtans position i förhållande till bröstet och bronkopulmonala strukturer. Inre detaljer som hjärtklaffar och väggtjocklek kan dock vara svåra att bedöma genom obduktion ensam. Således rekommenderas ECM-histopatologi för en avgörande diagnos. ECM-histopatologi är en högupplöst visualiseringsteknik som möjliggör både 2D- och 3D-rekonstruktion av bildstacken9. Dessa bilder erhålls genom seriell episkopisk fluorescerande avbildning av ett paraffininbäddat prov eftersom det är tunt snittat med ett konsekvent intervall av en automatisk mikrotom. Till skillnad från klassisk histologi fångas bilder som en sektion innan den klipps ut från blocket så att alla bilder tas inom samma referensram. På grund av detta kan 2D-bildstacken som produceras av ECM-histopatologi enkelt och tillförlitligt rekonstrueras i tre dimensioner. Detta görs med hjälp av en DICOM-tittare, vilket möjliggör 3D-visualisering av bilderna i de tre anatomiska planen: koronal, sagittal och tvärgående. Från dessa högupplösta 3D-rekonstruktioner kan en definitiv hjärtdiagnos göras. Tillämpningen av dessa tre olika visualiseringsmodaliteter, antingen var för sig eller i kombination, kan ge noggranna karakteriseringar av strukturella hjärtfel i musembryon.
Genmodifierade möss har använts för att förstå patomekanismerna vid medfödda hjärtfel. De protokoll vi tillhandahåller i denna studie försöker effektivisera och standardisera processen för att bedöma murina fosterhjärtfel. Det finns dock kritiska steg att notera under protokollet. Musembryon växer betydligt under varje graviditetsdag, och rätt tid att skörda en mus kan bestämmas genom att utföra ett fosterekokardiogram exakt. Fostrets ekokardiogram kan användas för att screena fostrets kardiovaskulär…
The authors have nothing to disclose.
Ingen.
1x phosphate-buffered saline solution (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
1.5 mL Eppendorf tubes (or preferred vial for tissue storage) | SealRite | 1615-5599 | |
10% buffered formalin phosphate solution | Fisher Chemical | SF100-4 | |
100% Ethanol | Decon Laboratories | 2701 | |
16% paraformaldehyde (PFA) fixative | ThermoScientific | 28908 | 4% working concentration freshly prepared in 1x PBS at 4 °C |
50 mL tubes | Falcon | 352070 | |
6–12 Well plate or 20 mL vial for embryo storage | Falcon | 353046 | |
Dissecting microscope | Leica | MDG36 | |
Dissecting Pins (A1 or A2 grade) | F.S.T | 26002-15 | |
Dissecting Plate | F.S.T | FB0875713 | Petri dish with paraffin base |
Embedding molds | Sakura | 4133 | |
Extra narrow scissors (10.5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1–2 pairs |
Fiji application/Image J | NIH | Fiji.sc | |
Fine tip (0.05 mm x 0.01 mm) Dissecting Forceps (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 Pairs |
Hot forceps | F.S.T | 11252-00 | For orientation of embryos |
Industrial Marker for Wax Blocks | Sharpie | 2003898 | Formatted for labratory use |
Jenoptik ProgRes C14plus Microscope Camera | Jenoptik | 017953-650-26 | |
Jenoptik ProgRess CapturePro acquisition software | Jenoptik | jenoptik.com | |
Large glass beaker | Fisher Scientific | S111053 | For melting paraffin |
Leica M165 FC binocular microscope (16.5:1 zoom optics) | Leica | M165 FC | |
OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
Paraplast embedding paraffin wax | Millipore Sigma | 1003230215 | |
Small glass beaker | Fisher Scientific | S111045 | |
Small, perforated spoon (14.5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
Straight Vannas Scissors (4–8 mm) | F.S.T | 15018-10 | A pair |
Vevo2100 ultrahigh-frequency ultrasound biomicroscope | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
Xylene | Fisher Chemical | UN1307 |