التعبير عن الجينات المحورة في ظهارة المسالك البولية في المثانة الأصلية باستخدام النقل بوساطة الفيروس الغدي
Summary
يتم وصف طرق لتوليد كميات كبيرة من الفيروسات الغدية المؤتلفة ، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحويل ظهارة القوارض الأصلية مما يسمح بالتعبير عن الجينات المحورة أو خفض تنظيم منتجات الجينات الداخلية.
Abstract
بالإضافة إلى تشكيل حاجز عالي المقاومة ، يفترض أن الظهارة البولية المبطنة للحوض الكلوي والحالب والمثانة والإحليل القريب لاستشعار ونقل المعلومات حول بيئتها إلى الأنسجة الكامنة ، مما يعزز وظيفة الإفراغ والسلوك. يمكن أن يؤدي تعطيل حاجز الظهارة البولية ، أو وظيفته الحسية / محول الطاقة ، إلى المرض. تعوق دراسة هذه الأحداث المعقدة عدم وجود استراتيجيات بسيطة لتغيير التعبير الجيني والبروتيني في الظهارة البولية. يتم وصف الطرق هنا التي تسمح للمحققين بتوليد كميات كبيرة من الفيروس الغدي عالي العيار ، والذي يمكن استخدامه بعد ذلك لتحويل ظهارة القوارض بكفاءة عالية ، وبطريقة مباشرة نسبيا. يمكن التعبير عن كل من cDNAs والحمض النووي الريبي الصغير المتداخل باستخدام نقل الفيروس الغدي ، ويمكن تقييم تأثير التعبير الجيني على وظيفة الظهارة البولية بعد 12 ساعة إلى عدة أيام. هذه الطرق لها قابلية تطبيق واسعة على دراسات بيولوجيا الظهارة البولية الطبيعية وغير الطبيعية باستخدام نماذج الفئران أو الفئران.
Introduction
الظهارة البولية هي الظهارة المتخصصة التي تبطن الحوض الكلوي والحالب والمثانة والإحليل القريب1. وهو يتألف من ثلاث طبقات: طبقة من الخلايا المظلة ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب في كثير من الأحيان، والتي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ وطبقة من الخلايا المظلية ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب، التي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ وطبقة من الخلايا المظلية ثنائية النواة شديدة التمايز والاستقطاب، التي تغمرها أسطحها القمية في البول؛ و طبقة خلية وسيطة مع مجموعة من الخلايا العابرة ثنائية النواة التي يمكن أن تؤدي إلى خلايا مظلة سطحية استجابة لفقدانها الحاد ؛ وطبقة واحدة من الخلايا القاعدية ، تعمل مجموعة فرعية منها كخلايا جذعية يمكنها تجديد كامل الظهارة البولية استجابة للإصابة المزمنة. الخلايا المظلية مسؤولة بشكل رئيسي عن تشكيل حاجز الظهارة البولية عالي المقاومة ، وتشمل مكوناته غشاء قمي (غني بالكوليسترول والمخيبروسيدات) مع نفاذية منخفضة للماء والمواد المذابة ، ومركب وصلة قمي عالي المقاومة (يتكون من تقاطعات ضيقة ، وتقاطعات ملتصقة ، وديسموسومات ، وحلقة أكتوميوسين مرتبطة بها) 1 . يتمدد كل من السطح القمي للخلية المظلية وحلقتها الموصلة أثناء ملء المثانة ويعودان إلى حالتهما المملوءة مسبقا بسرعة بعد إفراغ1،2،3،4،5. بالإضافة إلى دورها في وظيفة الحاجز ، يفترض أيضا أن يكون للظهارة البولية وظائف حسية ومحول طاقة تسمح لها باستشعار التغيرات في الوسط خارج الخلية (على سبيل المثال ، التمدد) ونقل هذه المعلومات عن طريق إطلاق الوسطاء (بما في ذلك ATP والأدينوزين والأسيتيل كولين) إلى الأنسجة الكامنة ، بما في ذلك عمليات العصب الوارد تحت الظهارة6،7،8 . تم العثور على أدلة حديثة على هذا الدور في الفئران التي تفتقر إلى التعبير البولية لكل من Piezo1 و Piezo2 ، مما يؤدي إلى تغيير وظيفة الإفراغ9. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفئران التي تفرط في التعبير عن البروتين CLDN2 المكون للمسام ذات الوصلات الضيقة في طبقة الخلية المظلة تصاب بالتهاب وألم مشابه لتلك التي تظهر في المرضى الذين يعانون من التهاب المثانة الخلالي10. من المفترض أن اضطراب وظيفة الظهارة البولية الحسية / محول الطاقة أو الحاجز قد يساهم في العديد من اضطرابات المثانة 6,11.
يعتمد الفهم الأفضل لبيولوجيا الظهارة البولية في الحالات الطبيعية والمرضية على توافر الأدوات التي ستسمح للمحققين بتقليل تنظيم التعبير الجيني الداخلي بسهولة أو السماح بالتعبير عن الجينات المحورة في الأنسجة الأصلية. في حين أن أحد الأساليب لتقليل تنظيم التعبير الجيني هو توليد فئران بالضربة القاضية الشرطية ، فإن هذا النهج يعتمد على توافر الفئران ذات الأليلات المتخبطة ، وهو كثيف العمالة ، ويمكن أن يستغرق شهورا إلى سنوات لإكمال12. ليس من المستغرب إذن أن يطور الباحثون تقنيات لنقل أو تحويل الظهارة البولية ، والتي يمكن أن تؤدي إلى نتائج على نطاق زمني أقصر. تشمل الطرق المنشورة للنقل استخدام الدهون الكاتيونية13 ، أو oligodeoxynucleotides المضادة للفسفور14 ، أو الأحماض النووية المضادة للحساسية المربوطة ببروتين فيروس نقص المناعة البشرية TAT الذي يخترق 11-merpeptide 15. ومع ذلك ، فإن تركيز هذا البروتوكول ينصب على استخدام التنبيغ بوساطة غدية ، وهي منهجية مدروسة جيدا وفعالة في توصيل الجينات إلى مجموعة واسعة من الخلايا ، وقد تم اختبارها في العديد من التجارب السريرية ، وتم استخدامها مؤخرا لتوصيل cDNA الذي يشفر بروتين قفيصة COVID-19 إلى متلقي متغير واحد من لقاح COVID-1916 ، 17. للحصول على وصف أكثر شمولا لدورة حياة الفيروس الغدي ، ونواقل الفيروسات الغدية ، والتطبيقات السريرية للفيروسات الغدية ، يتم توجيه القارئ إلى المرجع17.
كان معلما مهما في استخدام الفيروسات الغدية لتحويل الظهارة البولية ، تقريرا أعده Ramesh et al. أظهر معالجات مسبقة قصيرة بالمنظفات ، بما في ذلك N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) عززت بشكل كبير نقل الظهارة البولية بواسطة تشفير الفيروس الغدي β-galactosidase18. باستخدام دراسة إثبات المبدأ هذه كدليل ، تم الآن استخدام نقل الظهارة البولية بوساطة غدية للتعبير عن مجموعة متنوعة من البروتينات ، بما في ذلك GTPases من عائلة Rab ، وعوامل تبادل الجوانين ونوكليوتيدات ، وشظايا محرك الميوسين ، والكلاودينات المرتبطة بالوصلات الضيقة المكونة للمسام ، و ADAM17 10،19،20،21،22 . تم تكييف نفس النهج للتعبير عن الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNA) ، والذي تم إنقاذ آثاره من خلال التعبير المشترك عن المتغيرات المقاومة ل siRNA من الجيناتالمحورة 22. يتضمن البروتوكول الموصوف هنا طرقا عامة لتوليد كميات كبيرة من الفيروس الغدي عالي التركيز ، وهو مطلب لهذه التقنيات ، بالإضافة إلى تعديلات طرق Ramesh et al.18 للتعبير عن جينات التحوير في الظهارة البولية بكفاءة عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
بينما ركز Ramesh et al. على تطوير استراتيجيات لاستخدام نقل الفيروسات الغدية في علاج سرطان المثانة 18 ، أظهرت التقارير الحديثة فائدة هذه التقنيات في دراسة بيولوجيا الظهارة البولية الطبيعية / علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية 10،18،19،20<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال جائزة مشروع تجريبي من خلال P30DK079307 (إلى M.G.D.) ، منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK119183 (إلى GA و MDC) ، منحة المعاهد الوطنية للصحة R01DK129473 (إلى GA) ، جائزة التطوير الوظيفي لجمعية المسالك البولية الأمريكية ومنحة مؤسسة وينترز (إلى NM) ، من قبل فسيولوجيا الخلية والكائنات الحية النموذجية لتصوير الكلى في مركز بيتسبرغ لأبحاث الكلى (P30DK079307) ، وبواسطة S10OD028596 (إلى G.A.) ، التي مولت شراء نظام متحد البؤر المستخدم لالتقاط بعض الصور المعروضة في هذه المخطوطة.
Materials
| 10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
| 18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
| 20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
| 5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
| Cell culture dish – 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
| Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
| DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
| Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| IV catheter – mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
| IV catheter – rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
| Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
| Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
| Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
| Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
| Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
| Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip – sterile |
| Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip – sterile |
| Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
| TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
| Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
References
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
- Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
- Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
- Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
- Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
- Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
- Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
- Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
- Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
- Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
- Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
- Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
- Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
- Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
- Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
- Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
- Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
- Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
- Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
- Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
- Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
- Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).
