Expression de transgènes dans l’urothélium vésical natif par transduction médiée par adénovirus

Summary

Des méthodes sont décrites pour la génération de grandes quantités d’adénovirus recombinants, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium de rongeur natif permettant l’expression de transgènes ou la régulation négative de produits géniques endogènes.

Abstract

En plus de former une barrière à haute résistance, l’urothélium qui tapisse le bassinet du rein, les uretères, la vessie et l’urètre proximal est supposé détecter et transmettre des informations sur son environnement aux tissus sous-jacents, favorisant ainsi la fonction et le comportement de miction. La perturbation de la barrière urothéliale, ou de sa fonction sensorielle/transductrice, peut entraîner une maladie. L’étude de ces événements complexes est entravée par le manque de stratégies simples pour modifier l’expression des gènes et des protéines dans l’urothélium. Les méthodes décrites ici permettent aux chercheurs de générer de grandes quantités d’adénovirus à titre élevé, qui peuvent ensuite être utilisés pour transduire l’urothélium des rongeurs avec une grande efficacité et d’une manière relativement simple. Les ADNc et les petits ARN interférents peuvent être exprimés par transduction adénovirale, et l’impact de l’expression transgénique sur la fonction urothéliale peut être évalué 12 h à plusieurs jours plus tard. Ces méthodes ont une large applicabilité aux études de biologie urothéliale normale et anormale utilisant des modèles animaux de souris ou de rats.

Introduction

L’urothélium est l’épithélium spécialisé qui tapisse le bassinet du rein, les uretères, la vessie et l’urètre proximal¹. Il comprend trois strates : une couche de cellules parapluies hautement différenciées et polarisées, souvent binucléées, dont les surfaces apicales baignent dans l’urine ; une couche cellulaire intermédiaire avec une population de cellules binucléées amplifiant le transit qui peut donner naissance à des cellules parapluies superficielles en réponse à leur perte aiguë; et une seule couche de cellules basales, dont un sous-ensemble fonctionne comme des cellules souches qui peuvent régénérer la totalité de l’urothélium en réponse à une lésion chronique. Les cellules parapluies sont principalement responsables de la formation de la barrière urothéliale à haute résistance, dont les composants comprennent une membrane apicale (riche en cholestérol et en cérébrosides) avec une faible perméabilité à l’eau et aux solutés, et un complexe jonctionnel apical à haute résistance (composé de jonctions serrées, de jonctions adhérentes, de desmosomes et d’un cycle actomyosine associé)¹ . La surface apicale de la cellule parapluie et son anneau jonctionnel se dilatent pendant le remplissage de la vessie et reviennent rapidement à leur état pré-rempli après l’évacuation de 1,2,3,4,5. En plus de son rôle dans la fonction de barrière, on suppose également que l’urothélium a des fonctions sensorielles et transductrices qui lui permettent de détecter les changements dans le milieu extracellulaire (p. ex. étirement) et de transmettre cette information par la libération de médiateurs (y compris l’ATP, l’adénosine et l’acétylcholine) aux tissus sous-jacents, y compris les processus nerveux afférents sous-urothéliaux ^6,7,8 . Des preuves récentes de ce rôle sont trouvées chez les souris dépourvues d’expression urothéliale de Piezo1 et Piezo2, ce qui entraîne une altération de la fonction de miction⁹. De plus, les rats surexprimant la protéine CLDN2 formant des pores à jonction serrée dans la couche cellulaire parapluie développent une inflammation et une douleur analogues à celles observées chez les patients atteints de cystite interstitielle¹⁰. On suppose que la perturbation de la fonction sensorielle/transductrice urothéliale ou de la barrière peut contribuer à plusieurs troubles de la vessie ^6,11.

Une meilleure compréhension de la biologie de l’urothélium dans les états normaux et pathologiques dépend de la disponibilité d’outils qui permettront aux chercheurs de réguler facilement à la baisse l’expression des gènes endogènes ou de permettre l’expression des transgènes dans le tissu natif. Alors qu’une approche pour réguler à la baisse l’expression des gènes consiste à générer des souris knockout urothéliales conditionnelles, cette approche dépend de la disponibilité de souris avec des allèles floxés, nécessite beaucoup de travail et peut prendre des mois ou des années pour compléter¹². Il n’est donc pas surprenant que les chercheurs aient mis au point des techniques pour transfecter ou transduire l’urothélium, ce qui peut conduire à des résultats sur une échelle de temps plus courte. Les méthodes publiées pour la transfection comprennent l’utilisation de lipides cationiques¹³, d’oligodésoxynucléotides phosphorothioés antisens¹⁴ ou d’acides nucléiques antisens attachés à la protéine TAT du VIH pénétrant le peptide^{11-mère 15}. Cependant, ce protocole met l’accent sur l’utilisation de la transduction médiée par l’adénoviral, une méthodologie bien étudiée qui est efficace pour la livraison de gènes à un large éventail de cellules, qui a été testée dans de nombreux essais cliniques et, plus récemment, a été utilisée pour administrer l’ADNc codant pour la protéine de capside COVID-19 aux receveurs d’une variante du vaccin COVID-19^{16, 17}. Pour une description plus complète du cycle de vie de l’adénovirus, des vecteurs adénoviraux et des applications cliniques des adénovirus, le lecteur est invité à consulter la référence¹⁷.

Une étape importante dans l’utilisation des adénovirus pour transduire l’urothélium a été un rapport de Ramesh et al. qui a montré de courts prétraitements avec des détergents, y compris le N-dodécyl-β-D-maltoside (DDM) considérablement amélioré la transduction de l’urothélium par un adénovirus codant β-galactosidase¹⁸. En utilisant cette étude de preuve de principe comme guide, la transduction médiée par adénoviral de l’urothélium a maintenant été utilisée pour exprimer une variété de protéines, y compris les GTPases de la famille Rab, les facteurs d’échange guanine-nucléotide, les fragments moteurs de myosine, les claudines associées à la jonction serrée formant des pores et ADAM17 10,19,20,21,22 . La même approche a été adaptée pour exprimer de petits ARN interférents (siRNA), dont les effets ont été sauvés par la co-expression de variantes résistantes au siRNA du transgène²². Le protocole décrit ici comprend des méthodes générales pour générer de grandes quantités d’adénovirus hautement concentrés, une exigence pour ces techniques, ainsi que des adaptations des méthodes de Ramesh et ^al.18 pour exprimer les transgènes dans l’urothélium avec une grande efficacité.

Protocol

Les expériences impliquant la génération d’adénovirus, qui nécessite une certification BSL2, ont été réalisées avec l’approbation des bureaux de santé et de sécurité environnementales de l’Université de Pittsburgh et du comité institutionnel de biosécurité. Toutes les expériences sur les animaux effectuées, y compris la transduction adénovirale (qui nécessite une certification ABSL2), ont été effectuées conformément aux directives / règlements pertinents de la politique du service de santé…

Representative Results

Préparation du virusUn exemple de purification virale par centrifugation à gradient de densité est présenté à la figure 1A. La bande rose clair, située à l’interface du matériel cellulaire chargé et de la couche de CsCl de 1,25 g/mL, est principalement composée de cellules perturbées et de leurs débris (voir la flèche magenta à la figure 1A). Il tire sa couleur rosâtre de la petite quantité de milieu de culture qui est rep…

Discussion

Alors que Ramesh et coll. se concentraient sur l’élaboration de stratégies pour utiliser la transduction adénovirale dans le traitement du cancer de la vessie 18, des rapports plus récents ont démontré l’utilité de ces techniques dans l’étude de la biologie, de la physiologie urothéliale normale et de la physiopathologie 10,18,19,20,21<sup class…

Materials

10 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4488	sterile, serological pipette, individually wrapped
12 mL ultracentrifuge tube	ThermoFisher	06-752	PET thinwall ultracentrifuge tube
15 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352097	sterile
18 G needle	BD	305196	18 G x 1.5 in needle
20 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4489	sterile, serological pipette, individually wrapped
50 mL conical centrifuge tube	Falcon (Corning)	352098	sterile
5 mL pipette	Corning Costar (Millipore Sigma)	CLS4487	sterile, serological pipette, individually wrapped
Cavicide	Henry Schein	6400012	Anti-viral solution
Cell culture dish – 15 cm	Falcon (Corning)	353025	sterile, tissue-culture treated  (150 mm x 25 mm dish)
Cell scraper	Sarstedt	893.1832	handle length 24 cm, blade length 1.7 cm
CsCl	Millipore Sigma	C-4306	Molecular Biology grade ≥ 98%
DMEM culture medium (high glucose)	Gibco (ThermoFisher)	11965092	with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red
EDTA	Millipore Sigma	EDS	Bioiultra grade ≥ 99%
Fetal bovine serum	Hyclone (Cytiva)	SH30070.03	defined serum
Glass pipette	Fisher Scientific	13-678-20A	5.75 in glass pipette, autoclaved
Glycerol	Millipore Sigma	G-5516	Molecular Biology grade ≥ 99%
HEK293 cells	ATCC	CRL-3216	HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen
Isoflurane	Covetrus	29405
IV catheter – mouse	Smith Medical Jelco	3063	24 G x 3/4 in Safety IV catheter  radiopaque
IV catheter – rat	Smith Medical Jelco	3060	22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque
KCl	Millipore Sigma	P-9541	Molecular Biology grade ≥ 99%
KH2PO4	Millipore Sigma	P5655	Cell culture grade  ≥ 99%
Na2HPO4•7 H2O	Millipore Sigma	431478	≥ 99.99%
NaCl	Millipore Sigma	S3014	Molecular Biology grade ≥ 99%
N-dodecyl-β-D-maltoside	Millipore Sigma	D4641	≥ 98%
Nose cone for multiple animals	custom designed		commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200)
PD-10 column	GE Healthcare	17-085-01	Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M
Penicillin/streptomycin antibiotic (100x)	Gibco (ThermoFisher)	15070063	100x concentrated solution
Spectrophotometer	Eppendorf	BioPhotometer
Stand and clamp	Fisher Scientific	14-679Q and 05-769-8FQ	available from numerous suppliers
Sterile filter unit	Fisher Scientific (Nalgene)	09-740-65B	0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL)
Sterile filter unit 0.2 µm (syringe)	Fisher Scientific	SLGV004SL	Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe
Super speed centrifuge	Eppendorf	5810R	with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm)
Syringe (1 mL)	BD	309628	1-mL syringe Luer-lok tip – sterile
Syringe (3 mL)	BD	309656	3-mL syringe slip tip – sterile
Table-top centrifuge (low speed)	Eppendorf	5702	with swinging bucket rotor
Transfer pipettes	Fisher Scientific	13-711-9AM	polyethylene 3.4 mL transfer pipette
Tris-base	Millipore Sigma	648310-M	Molecular Biology grade
TrypLE select protease solution	Gibco (ThermoFisher)	12604013	TrypLE express enzyme (1x), no phenol red
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima L-80 XP	with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm)
Vaporizer	General Anesthetic Services, Inc.	Tec 3	Isoflurane vaporizer
Vortex Mixer	VWR	10153-838	analog vortex mixer