एडेनोवायरस-मध्यस्थता पारगमन का उपयोग करके मूल मूत्राशय यूरोथेलियम में ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति
Summary
पुनः संयोजक एडेनोवायरस की बड़ी मात्रा की पीढ़ी के लिए विधियों का वर्णन किया गया है, जिसका उपयोग तब देशी कृंतक यूरोथेलियम को ट्रांसड्यूस करने के लिए किया जा सकता है जो ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति या अंतर्जात जीन उत्पादों के डाउनरेग्यूलेशन की अनुमति देता है।
Abstract
एक उच्च प्रतिरोध बाधा बनाने के अलावा, गुर्दे की श्रोणि, मूत्रवाहिनी, मूत्राशय और समीपस्थ मूत्रमार्ग को अस्तर करने वाले यूरोथेलियम को अंतर्निहित ऊतकों को अपने पर्यावरण के बारे में जानकारी को समझने और प्रसारित करने के लिए परिकल्पित किया जाता है, जिससे शून्यता कार्य और व्यवहार को बढ़ावा मिलता है। यूरोथेलियल बाधा, या इसके संवेदी / ट्रांसड्यूसर फ़ंक्शन का विघटन, बीमारी का कारण बन सकता है। इन जटिल घटनाओं का अध्ययन यूरोथेलियम में जीन और प्रोटीन अभिव्यक्ति को बदलने के लिए सरल रणनीतियों की कमी से बाधित होता है। विधियों का वर्णन यहां किया गया है जो जांचकर्ताओं को बड़ी मात्रा में उच्च-टिटर एडेनोवायरस उत्पन्न करने की अनुमति देते हैं, जिसका उपयोग तब उच्च दक्षता के साथ कृंतक यूरोथेलियम को ट्रांसड्यूस करने के लिए किया जा सकता है, और अपेक्षाकृत सरल तरीके से। सीडीएनए और छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए दोनों को एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करके व्यक्त किया जा सकता है, और यूरोथेलियल फ़ंक्शन पर ट्रांसजेन अभिव्यक्ति के प्रभाव का आकलन 12 घंटे से कई दिनों बाद किया जा सकता है। माउस या चूहे पशु मॉडल का उपयोग करके सामान्य और असामान्य यूरोथेलियल जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए इन विधियों की व्यापक प्रयोज्यता है।
Introduction
यूरोथेलियम विशेष उपकला है जो गुर्दे की श्रोणि, मूत्रवाहिनी, मूत्राशय और समीपस्थ मूत्रमार्ग1 को रेखाबद्ध करता है। इसमें तीन स्तर शामिल हैं: अत्यधिक विभेदित और ध्रुवीकृत अक्सर द्वि-न्यूक्लियेट छाता कोशिकाओं की एक परत, जिनकी एपिकल सतहों को मूत्र में स्नान किया जाता है; द्वि-न्यूक्लियेट पारगमन-प्रवर्धक कोशिकाओं की आबादी के साथ एक मध्यवर्ती कोशिका परत जो उनके तीव्र नुकसान के जवाब में सतही छाता कोशिकाओं को जन्म दे सकती है; और बेसल कोशिकाओं की एक एकल परत, जिनमें से एक उप-समूह स्टेम कोशिकाओं के रूप में कार्य करता है जो पुरानी चोट के जवाब में यूरोथेलियम की संपूर्णता को पुनर्जीवित कर सकता है। छाता कोशिकाएं मुख्य रूप से उच्च-प्रतिरोध यूरोथेलियल बाधा बनाने के लिए जिम्मेदार होती हैं, जिनमें से घटकों में पानी और विलेय के लिए कम पारगम्यता के साथ एक एपिकल झिल्ली (कोलेस्ट्रॉल और सेरेब्रोसाइड में समृद्ध) और एक उच्च प्रतिरोध एपिकल जंक्शनल कॉम्प्लेक्स (तंग जंक्शन, पालन जंक्शन, डेस्मोसोम और एक संबंधित एक्टोमायोसिन रिंग शामिल) शामिल हैं। . छाता कोशिका की एपिकल सतह और इसकी जंक्शन रिंग दोनों मूत्राशय भरने के दौरान फैलते हैं और 1,2,3,4,5 को शून्य करने के बाद तेजी से अपनी पूर्व-भरी स्थिति में लौट आते हैं। बैरियर फ़ंक्शन में इसकी भूमिका के अलावा, यूरोथेलियम को संवेदी और ट्रांसड्यूसर कार्यों के लिए भी परिकल्पित किया जाता है जो इसे बाह्य परिवेश (जैसे, खिंचाव) में परिवर्तन को समझने की अनुमति देता है और मध्यस्थों (एटीपी, एडेनोसिन और एसिटाइलकोलाइन सहित) की रिहाई के माध्यम से इस जानकारी को अंतर्निहित ऊतकों तक पहुंचाता है, जिसमें सबरोथेलियल अभिवाही तंत्रिका प्रक्रियाएं 6,7,8 शामिल हैं। . इस भूमिका के हालिया सबूत चूहों में पाए जाते हैं जिनमें पीज़ो 1 और पीज़ो 2 दोनों की यूरोथेलियल अभिव्यक्ति की कमी होती है, जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तित शून्यीकरण फ़ंक्शन9 होता है। इसके अतिरिक्त, छाता कोशिका परत में तंग-जंक्शन छिद्र बनाने वाले प्रोटीन सीएलडीएन 2 को अतिरंजित करने वाले चूहों में अंतरालीय सिस्टिटिस10 वाले रोगियों में देखी गई सूजन और दर्द विकसित होता है। ट्रांसड्यूसर या बैरियर फ़ंक्शन का विघटन कई मूत्राशयविकारों में योगदान कर सकता है 6,11.
सामान्य और रोग राज्यों में यूरोथेलियम के जीव विज्ञान की बेहतर समझ उपकरणों की उपलब्धता पर निर्भर करती है जो जांचकर्ताओं को आसानी से अंतर्जात जीन अभिव्यक्ति को कम करने या देशी ऊतक में ट्रांसजेन की अभिव्यक्ति की अनुमति देने की अनुमति देगी। जबकि जीन अभिव्यक्ति को डाउनरेगुलेट करने का एक दृष्टिकोण सशर्त यूरोथेलियल नॉकआउट चूहों को उत्पन्न करना है, यह दृष्टिकोण फ्लोक्स्ड एलील्स वाले चूहों की उपलब्धता पर निर्भर करता है, श्रम गहन है, और12 को पूरा करने में महीनों से लेकर वर्षों तक का समय लग सकता है। आश्चर्य की बात नहीं है, जांचकर्ताओं ने यूरोथेलियम को स्थानांतरित या ट्रांसड्यूस करने के लिए तकनीकें विकसित की हैं, जिससे कम समय के पैमाने पर परिणाम हो सकते हैं। अभिकर्मक के लिए प्रकाशित तरीकों में धनिक लिपिड13, एंटी-सेंस फॉस्फोरोथियोटेड ऑलिगोडीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड्स14, या एंटीसेंस न्यूक्लिक एसिड का उपयोग शामिल है जो एचआईवी टीएटी प्रोटीन पेनिट्रेटिंग 11-मेर पेप्टाइड15 से जुड़ा हुआ है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल का फोकस एडेनोवायरल-मध्यस्थता पारगमन के उपयोग पर है, एक अच्छी तरह से अध्ययन की गई पद्धति जो कोशिकाओं की एक विस्तृत श्रृंखला में जीन वितरण में कुशल है, का कई नैदानिक परीक्षणों में परीक्षण किया गया है, और हाल ही में इसका उपयोग कोविड-19 वैक्सीन16 के एक संस्करण के प्राप्तकर्ताओं को कोविड-19 कैप्सिड प्रोटीन एन्कोडिंग करने वाले सीडीएनए को वितरित करने के लिए किया गया था। 17. एडेनोवायरस जीवन चक्र, एडेनोवायरल वैक्टर और एडेनोवायरस के नैदानिक अनुप्रयोगों के अधिक गहन विवरण के लिए, पाठक कोसंदर्भ 17 के लिए निर्देशित किया जाता है।
यूरोथेलियम को ट्रांसड्यूस करने के लिए एडेनोवायरस के उपयोग में एक महत्वपूर्ण मील का पत्थर, रमेश एट अल की एक रिपोर्ट थी, जिसमें डिटर्जेंट के साथ छोटे पूर्वउपचार दिखाए गए थे, जिसमें एन-डोडेसिल-β-डी-माल्टोसाइड (डीडीएम) शामिल थे, जो एडेनोवायरस एन्कोडिंग β-गैलेक्टोसिडेज18 द्वारा यूरोथेलियम के पारगमन को नाटकीय रूप से बढ़ाते थे। एक गाइड के रूप में इस प्रमाण-सिद्धांत अध्ययन का उपयोग करते हुए, यूरोथेलियम के एडेनोवायरल-मध्यस्थता पारगमन का उपयोग अब विभिन्न प्रकार के प्रोटीनों को व्यक्त करने के लिए किया गया है, जिसमें आरएबी-परिवार जीटीपेस, गुआनिन-न्यूक्लियोटाइड विनिमय कारक, मायोसिन मोटर टुकड़े, छिद्र बनाने वाले तंग जंक्शन से जुड़े क्लॉडिन और एडीएएम 17 10,19,20,21,22 शामिल हैं। . उसी दृष्टिकोण को छोटे हस्तक्षेप करने वाले आरएनए (सीआरएनए) को व्यक्त करने के लिए अनुकूलित किया गया था, जिसके प्रभावों को ट्रांसजीन22 के सीआरएनए-प्रतिरोधी वेरिएंट को सह-व्यक्त करके बचाया गया था। यहां वर्णित प्रोटोकॉल में बड़ी मात्रा में अत्यधिक केंद्रित एडेनोवायरस उत्पन्न करने के सामान्य तरीके शामिल हैं, जो इन तकनीकों के लिए एक आवश्यकता है, साथ ही उच्च दक्षता के साथ यूरोथेलियम में ट्रांसजेन व्यक्त करने के लिए रमेश एट अल .18 के तरीकों के अनुकूलन भी शामिल हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
जबकि रमेश और अन्य मूत्राशय के कैंसर 18 के उपचार में एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन का उपयोग करने के लिए रणनीतियों को विकसित करने पर केंद्रित थे, हाल की रिपोर्टों ने सामान्य यूरोथेलियल जीव विज…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को P30DK079307 (M.G.D.D.), NIH अनुदान R01DK119183 (G.A. और M.D.C. को), NIH अनुदान R01DK129473 (G.A.), एक अमेरिकन यूरोलॉजी एसोसिएशन कैरियर डेवलपमेंट अवार्ड और विंटर्स फाउंडेशन अनुदान (N.M.) के माध्यम से एक पायलट प्रोजेक्ट अवार्ड द्वारा समर्थित किया गया था। और S10OD028596 (G.A.) द्वारा, जिसने इस पांडुलिपि में प्रस्तुत कुछ छवियों को पकड़ने के लिए उपयोग की जाने वाली कॉन्फोकल प्रणाली की खरीद को वित्त पोषित किया।
Materials
| 10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
| 18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
| 20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
| 5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
| Cell culture dish – 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
| Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
| DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
| Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| IV catheter – mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
| IV catheter – rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
| Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
| Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
| Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
| Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
| Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
| Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip – sterile |
| Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip – sterile |
| Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
| TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
| Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
References
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
- Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
- Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
- Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
- Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
- Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
- Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
- Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
- Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
- Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
- Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
- Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
- Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
- Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
- Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
- Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
- Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
- Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
- Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
- Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
- Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
- Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).
