Summary
تصف هذه الورقة بروتوكول منااعي للعقد الجذرية الظهرية للفأر البالغ. من خلال لصق الأجسام المضادة بألواح الثقافة ، يمكننا اختيار الخلايا غير العصبية وإزالتها بشكل سلبي. نظهر أن الثقافات يتم إثراؤها للخلايا العصبية باستخدام هذا البروتوكول ، مما يسمح بإجراء دراسة متعمقة للاستجابات العصبية للتلاعب.
Abstract
العقد الجذرية الظهرية (DRGs) هي هياكل طرفية مجاورة للقرن الظهري للحبل الشوكي ، والتي تضم أجسام الخلايا العصبية الحسية بالإضافة إلى أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى. غالبا ما تشير بروتوكولات الثقافة المنشورة إلى ثقافات DRG المنفصلة بالكامل على أنها خلايا عصبية ، على الرغم من وجود الخلايا الليفية وخلايا شوان والبلاعم والخلايا الليمفاوية. في حين أن ثقافات DRG بأكملها كافية لتطبيقات التصوير حيث يمكن تمييز الخلايا العصبية بناء على التشكل أو التلوين ، فإن تجانسات البروتين أو الحمض النووي الريبي التي تم جمعها من هذه الثقافات ليست عصبية في الأصل في المقام الأول. هنا ، نصف تسلسل المناعة ل DRGs الفئران المستزرعة. الهدف من هذه الطريقة هو إثراء ثقافات DRG للخلايا العصبية عن طريق إزالة أنواع الخلايا الأخرى. يشير Immunopanning إلى طريقة لإزالة أنواع الخلايا عن طريق لصق الأجسام المضادة بأطباق زراعة الخلايا. باستخدام هذه الأطباق ، يمكننا الاختيار السلبي وتقليل عدد الخلايا الليفية والخلايا المناعية وخلايا شوان في الثقافة. تسمح لنا هذه الطريقة بزيادة نسبة الخلايا العصبية في الثقافات.
Introduction
تضم العقد الجذرية الظهرية (DRGs) أجسام الخلايا العصبية الحسية التي تعصب الأنسجة المحيطية. تسمح لنا دراسة هذه الخلايا العصبية بفهم الأسس الميكانيكية للألم والظروف الحسية. ومع ذلك ، لا تتكون DRGs من الخلايا العصبية وحدها ، ولكنها تحتوي أيضا على الخلايا الليفية وخلايا Schwann والبلاعم والخلايا المناعية الأخرى1. على الرغم من وجود هذه الأنواع المختلفة من الخلايا ، غالبا ما يشار إلى ثقافات DRG بأكملها في الأدبيات باسم الخلايا العصبية 2,3. لا تزال هذه الثقافات مفيدة للتحقيق العصبي عن طريق التصوير أو قياس التدفق الخلوي ، مما يسمح بتحديد الخلايا العصبية عن طريق التلوين و / أو حجم الخلية و / أو التشكل. ومع ذلك ، بالنسبة للمقايسات مثل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أو النشاف الغربي ، حيث يتم تجانس الثقافات لجمع الحمض النووي الريبي أو البروتين ، قد يتداخل وجود أنواع الخلايا غير العصبية مع النتائج. وبالتالي ، هناك حاجة لزيادة نسبة الخلايا العصبية في مزارع DRG.
Immunopanning هي تقنية تستخدم لتنقية مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا ، بما في ذلك الخلايا العصبية القشرية ، والخلايا النجمية ، وخلايا سلائف oligodendrocyte ، والخلايا الدبقية الصغيرة. بكلمات بسيطة ، يتضمن لصق جسم مضاد ضد علامة سطح الخلية بطبق بتري ، يهدف إلى ربط خلايا معينة (الشكل 1) ، ويمكن استخدامه لتحديد إما مع أو ضد أنواع الخلايا ذات الأهمية4،5،6. تم وصف DRGs الجنينية للفئران المناعية للاختيار ضد الخلايا غير العصبية سابقا بواسطة Zuchero7. ومع ذلك ، لم نتمكن من العثور على بروتوكول مناعي خاص ب DRGs للماوس. في هذا البروتوكول ، نبني على المستأجرين الأساسيين لبروتوكول Zuchero ، ولكن بدلا من ذلك قمنا بتكييف تسلسل المناعة لإثراء ثقافات DRG للفأر البالغ (الشكل 2). هذه أداة قوية لدراسة الخلايا العصبية الحسية الراسخة في الثقافة. إنه مفيد لأنه يسمح باستخدام الفئران البالغة من النماذج الوراثية والمرضية والإصابات ، بحيث يمكن دراسة الخلايا العصبية الحسية الخاصة بهم بمزيد من التحديد.
هذا البروتوكول مفيد للقراء الذين يتطلعون إلى زيادة نسبة الخلايا العصبية في مزارع DRG للفأر البالغ. ومع ذلك ، يمكن أيضا حذف خطوات المناعة ، ويمكن أيضا استخدام هذا البروتوكول لثقافات DRG بأكملها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات بموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان للعلوم الصحية بجامعة ألبرتا (البروتوكول 0000274).
1. إعداد الكاشف
- لليوم 1 ، قم بإعداد الكواشف التالية: ماء زراعة الخلايا ؛ poly-D-lysine - تحضير مخزون عن طريق إعادة تكوين الزجاجة بأكملها في 50 مل من ماء درجة الاستزراع إلى تركيز مخزون 100 ميكروغرام / مل ، وتخزينها عند 4 درجات مئوية ، وتخفيف المخزون 1:10 في ماء درجة الاستزراع إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل ؛ tris-HCl- تحضير مخزون عن طريق إذابة مسحوق تريس هيدروكلوريد في ماء درجة الاستزراع إلى تركيز مخزون يبلغ 500 مللي مول (3.94 جم في 50 مل) ، ودرجة الحموضة 9.5 ، وتعقيم المرشح (0.22 ميكرومتر) ، وتخزينه عند 4 درجات مئوية ، وتخفيف المخزون 1:10 في ماء درجة الاستزراع إلى تركيز نهائي قدره 50 مللي مول ؛ الأجسام المضادة الثانوية (الماعز المضادة للفئران ، الأرنب ، والفأر).
- لليوم 2 ، قم بإعداد الكواشف التالية.
- تحضير محلول ملح هانك المتوازن من الدرجة Ca 2+ ، محلول ملح هانك المتوازن الخاليمن Mg 2+ (HBSS; HBSS-/-) ، ومحلول ملحي مخزن D-phosphate بدرجة زراعة الخلايا (PBS) مع Ca 2+ و Mg2+. قم بإعداد حصص مخزون اللامينين وتخزينه عند -80 درجة مئوية فور استلامه ؛ تمييع المخزون في HBSS المعقم إلى تركيز نهائي قدره 10 ميكروغرام / مل للمخزون العامل.
- قم بإعداد 4٪ من مخزون ألبومين مصل الأبقار (BSA) عن طريق إذابة 400 مجم من BSA في 7.5 مل من D-PBS (درجة الحموضة 7.4) ، ورفع الحجم إلى 10 مل ، وتعقيم المرشح (0.22 ميكرومتر) ، والقسمة ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية. تحضير 0.2٪ BSA عن طريق تخفيف 750 ميكرولتر من 4٪ BSA في 14.25 مل من D-PBS.
- قم بإعداد 0.4٪ من مخزون DNAse عن طريق إضافة 1 مل من محلول الملح المتوازن من Earle (EBSS) لكل 12500 وحدة من DNAse ، وتعقيم المرشح (0.22 ميكرومتر) ، والقسمة ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية. قم بإعداد المخزن المؤقت للتحريك (0.02٪ BSA) بإضافة 3 مل من 0.2٪ BSA و 100 ميكرولتر من 0.4٪ DNAse في 27 مل من D-PBS. تحضير الأجسام المضادة الأولية (CD45 ، PDGRFβ ، O4).
ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول الورم الهجين O4 8,9 ، ومع ذلك ، فإن 10 ميكروغرام من الجسم المضاد O4 المتاح تجاريا سيكون مناسبا أيضا. - تحضير مزيج كولاجيناز المرق عن طريق إذابة زجاجة من كولاجيناز المركب (50 ملغ) في 5 مل من HBSS-/- ، القسمة ، وتخزينها في -20 درجة مئوية. قم بإعداد مخزون عامل لكل فأرين عن طريق إضافة 500 ميكرولتر من كولاجيناز مركب دافئ و 50 ميكرولتر من إنزيم DNase المسخن 0.4٪ إلى 4.5 مل من HBSS-/-.
- تحضير البويضات منخفضة عن طريق إضافة 3 غرام من BSA إلى 150 مل من D-PBS ، ثم إضافة 3 غرام من مثبطات التربسين وتخلط لتذوب. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 وارفع مستوى الصوت إلى 200 مل باستخدام D-PBS. قم بتصفية التعقيم ، وإعداد 1 مل من الحصص ، وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية. في يوم التشريح ، اجمع بين 1 مل من البويضات المنخفضة في 9 مل من D-PBS لحل العمل.
- تحضير 15٪ من BSA عن طريق إذابة 7.5 جم من BSA في 50 مل من HBSS-/- (ضعه على شاكر ليذوب تماما) ، وقم بتعقيمه بالترشيح وتخزينه عند 4 درجات مئوية.
- تحضير 50 مل من وسائط الخلايا العصبية بإضافة 23.2 مل من DMEM ، 23.2 مل من الوسط العصبي القاعدي ، 500 ميكرولتر من الجلوتاماكس ، 500 ميكرولتر من بيروفات الصوديوم ، 500 ميكرولتر من البنسلين / الستربتومايسين (القسمة فور الوصول وتخزينها عند -20 درجة مئوية) ، 500 ميكرولتر من الأنسولين (5 ميكروغرام / مل نهائي) ، 500 ميكرولتر من SATO ، 50 ميكرولتر من N-acetyl-L-cysteine (NAC ؛ 5 ميكروغرام / مل نهائي) ، و 1000 ميكرولتر من B27 + (القسمة على الفور وتخزينها عند -20 درجة مئوية عند الاستلام).
- قم بإعداد مخزون الأنسولين عن طريق إذابة محلول في ماء درجة الاستزراع إلى تركيز 0.5 مجم / مل (50 مجم في 100 مل) ، واضبط درجة الحموضة على 7.4 ، وقم بتعقيم المرشح (0.22 ميكرومتر) ، وقم بإعداد 500 ميكرولتر من القسمة ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
- قم بإعداد مخزون SATO عن طريق الجمع بين 20 ميكرولتر من هرمون البروجسترون (2.5 مجم في 100 ميكرولتر من الإيثانول) ، و 800 ميكرولتر من سيلينيت الصوديوم (4 مجم في 10 مل من الوسائط العصبية القاعدية + 10 ميكرولتر من 1 N NaOH) ، و 800 مجم من BSA ، و 800 مجم من الترانسفيرين ، و 128 مجم من بوتريسين ثنائي هيدروكلوريد ، و 80 مل من الخلايا العصبية القاعدية. تعقيم المرشح (0.22 ميكرومتر) ، وإعداد 500 ميكرولتر من القسامات ، وتخزينها في -20 درجة مئوية. من الضروري صنع محاليل البروجسترون والسيلينيت الصوديوم.
- تحضير 50 ميكرولتر من مخزون N-acetyl-L-cysteine (NAC) عن طريق إذابته في وسط عصبي قاعدي إلى تركيز مخزون 5 مجم / مل (50 مجم في 10 مل) ، وتعقيم المرشح (0.22 ميكرومتر) ، والقسمة ، وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
- لليوم 4 و 5 ، قم بإعداد الكواشف التالية.
- تحضير 0.2 M فوسفات عازلة (PB) عن طريق إذابة 21.8 جم من فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na 2 HPO 4)و 8.34 جم من ثنائي هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaH2PO4) في 1000 مل من الماء. اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 واحفظه في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير 8٪ بارافورمالدهيد (PFA) على النحو التالي: في غطاء الدخان ، قم بتسخين 50 مل من الماء إلى 55 درجة مئوية ، وأطفئ النار ، وأضف 8 جم من حبيبات PFA ، مع التحريك باستمرار. أضف 1 N NaOH بالتنقيط حتى يبدأ المحلول في الوضوح ، ثم أضف 40 مل من 0.2 M PB ، واستمر في التقليب حتى يصبح صافيا. قم بتبريد المحلول إلى درجة حرارة الغرفة ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 ، وارفع مستوى الصوت إلى 100 مل مع 0.2 متر بيتا. تصفية وتخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
- قم بإعداد D-PBS + Triton X-100 (PBSTX) بإضافة 0.2٪ Triton X-100 في درجة الثقافة D-PBS (1 مل من Triton + 500 مل من D-PBS). يحفظ في درجة حرارة 4 درجة مئوية. تحضير محلول الحجب ، وهو 1٪ مصل حمار طبيعي (NDS) في PBSTX. في وقت مبكر ، يمكن تحضير 1 مل من NDS + 9 مل من PBSTX وتخزينها عند -20 درجة مئوية في 10 مل من القسامة.
- تحضير محلول الأجسام المضادة وهو 0.2٪ NDS / 0.2٪ BSA في PBS TX: 200 ميكرولتر من NDS + 200 مجم BSA + 9.6 مل من PBSTX ؛ يمكن تحضيرها مسبقا وتخزينها في -20 درجة مئوية في حصصا سعة 10 مل.
2. إعداد المعدات
- قم بإعداد المعدات التالية: خزانة السلامة الحيوية لثقافة الخلايا المعقمة ، مجموعة الماصة الدقيقة ، الماصات المصلية ومسدس الماصة ، أطباق بتري 10 سم ، أطباق زراعة الخلايا المرغوبة للطلاء (هنا ، تم استخدام 24 لوحة زجاجية سوداء للتصوير) ، 15 مل و 50 مل أنابيب مخروطية ، أدوات تشريح (وهي: مقص الربيع الناعم لاستئصال الصفيحة الفقرية وتقليم الأعصاب ، ملقط ناعم ، وشفرة حلاقة) ، حمام مائي مضبوط على 37 درجة مئوية ، مصفاة خلية 70 ميكرومتر ، جهاز طرد مركزي (10 دقائق عند 300 × جم) مع محولات لأنابيب مخروطية سعة 15 مل ، ومقياس تريبان الأزرق ومقياس الدم ، وغطاء الدخان ، ولوحة تسخين التحريك المغناطيسي.
3. الطريقة التجريبية
- يوم 1: إعداد الأطباق
- في خزانة السلامة الحيوية ، قم بتغطية سطح الاستزراع المطلوب بما يكفي من poly-D-lysine لتغطية قاع البئر. يحفظ طوال الليل على حرارة 4 درجات مئوية. هنا ، تم استخدام ألواح زجاجية ذات قاع زجاجي 24 بئرا للتصوير ، وبالتالي تم استخدام 300 ميكرولتر من poly-D-lysine.
- في خزانة السلامة الأحيائية ، قم بإعداد أطباق التحريك: بالنسبة لطبق CD45 ، أضف 10 مل من محلول tris-HCl العامل و 30 ميكرولتر من IgG المضاد للفئران الماعز إلى طبق بتري 10 سم ؛ بالنسبة لطبق PDGFRβ ، أضف 10 مل من محلول tris-HCl العامل و 30 ميكرولتر من IgG المضاد للأرانب الماعز إلى طبق بتري 10 سم ؛ بالنسبة لطبق الورم الهجين O4 ، أضف 10 مل من محلول tris-HCl العامل و 30 ميكرولتر من IgG المضاد للفأر الماعز إلى طبق بتري 10 سم. تأكد من أن المحلول يغطي منطقة الطبق بالكامل واتركه عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
- اليوم 2: التشريح ، التثليج ، والمناعة
- قم بنضح poly-D-lysine ، واغسل الألواح ثلاث مرات بماء زراعة الأنسجة ، وقم بإمالة الغطاء مفتوحا ، واترك السطح يجف تماما في خزانة السلامة الحيوية. ضع كمية كافية من اللامينين على الأطباق لتغطية قاع كل بئر ، وضعها في حاضنة عند 37 درجة مئوية. بالنسبة لألواح 24 بئرا ، يكفي 200 ميكرولتر.
- الانتهاء من إعداد أطباق التحريك. اغسل كل طبق باستخدام D-PBS واحتضانه ب 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة الأولية. السماح للجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على الأقل.
- بالنسبة لطبق CD45 ، أضف 5 مل من 0.2٪ BSA و 20 ميكرولتر من CD45 الأساسي ؛ بالنسبة لطبق PDGFRβ ، أضف 5 مل من 0.2٪ BSA و 15.4 ميكرولتر من PDGFRβ ؛ بالنسبة لطبق O4 ، أضف 3 مل من 0.2٪ BSA ، و 2 مل من الورم الهجين O4 ، و 100 ميكرولتر إضافية من 4٪ BSA (لضمان بقاء تركيز BSA النهائي عند 0.2٪).
- القتل الرحيم من واحد إلى أربعة فئران باستخدام 0.1 مل / كجم بنتوباربيتول الصوديوم (لكل طبق مناعي 10 سم). استخدمنا الفئران C57BL / 6 في عمر 8-10 أسابيع. تم استخدام كلا الجنسين وثقافتهما بشكل منفصل عن بعضهما البعض. بيرف الحيوان مع 30 مل من البرد 0.9 ٪ المالحة.
- ثبت الكفوف الأمامية والخلفية على مرحلة الستايروفوم واستخدم شفرة حلاقة نظيفة لفضح العمود الفقري من الخلف. قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية عن طريق إجراء جروح بعمق نصف الطريق تقريبا على جانبي العمود الفقري الظهري ، وإزالة النصف الظهري من العمود ، لكشف الحبل الشوكي. إما قطع الأعصاب برفق وإزالة الحبل الشوكي ، أو دفع الحبل برفق إلى الجانب ، والحفاظ على سلامة الأعصاب.
- استخدم جذور الأعصاب الشوكية (إما مقطوعة أو متصلة بالحبل الشوكي) للعثور على جميع DRGs وإزالتها من جانبي العمود الفقري. قم بقص حطام الأعصاب من كل DRG أثناء إزالته (قد يؤدي المزيد من بقايا الأعصاب في المزرعة إلى ضعف بقاء الثقافة). اجمع DRGs في 15 مل من HBSS-/- في أنبوب مخروطي سعة 15 مل على الجليد.
ملاحظة: لاحظ أن الأنسجة يتم تشريحها في الهواء الطلق ، ولكن بمجرد إضافة DRGs إلى الأنبوب ، يجب معاملتها على أنها معقمة ويتم التلاعب بها فقط في خزانة السلامة البيولوجية. - ضع مخزونا مجمدا من stemxyme 1 و 0.4٪ DNAse في حمام مائي ، قبل 30 دقيقة تقريبا من نهاية التشريح (تقريبا عند بدء تشغيل الفأر الأخير). اسمح لهم بالاستقرار في قاع الأنبوب المخروطي ، ثم تابع البروتوكول في خزانة السلامة الحيوية.
- نضح معظم HBSS - / - من DRGs. استخدم ماصة بدلا من الشفط للحصول على <1 مل من السائل ، واترك ~ 100 ميكرولتر سائل حتى لا تخاطر بفقدان الأنسجة.
- يغسل ثلاث مرات مع 1 مل من HBSS-/-. أضف 5 مل من محلول stemxyme العامل إلى الأنسجة. قم بتغطية الغطاء بغشاء شفاف وقم بتعويم الأنبوب على جانبه في حمام مائي مضبوط على 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- بعد الحضانة في الإنزيم ، أضف 1 مل من محلول مثبط البيض المنخفض إلى الأنبوب. سحن الخلايا بلطف باستخدام ماصة p1000 10-15 مرة. اسمح لقطع الأنسجة بالاستقرار.
- انقل أعلى 2-3 مل من المحلول (يحتوي على خلايا منفصلة) إلى محلول بيضوي منخفض جديد. كرر حتى يتم فصل الأنسجة تماما ولا تبقى قطع مرئية.
- جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة. قم بسحب المادة الطافية مرة أخرى ، باستخدام ماصة بدلا من الشفط لآخر 1 مل ، وترك ~ 100 ميكرولتر ، وأعد تعليق حبيبات الخلية في 1 مل من المخزن المؤقت للتحريك.
- ماصة بلطف لخلط. بلل مسبقا مصفاة خلية 70 ميكرومتر مع 1 مل من المخزن المؤقت للتحريك على أنبوب مخروطي سعة 50 مل. قم بتصفية محلول الخلية من خلال مصفاة الخلية.
- اغسل الأنبوب ب 1 مل من محلول التحريك ، ثم مرر عبر المصفاة (3 مل من المرشح). ضع طبقة من معلق الخلية برفق (1 مل في المرة الواحدة) فوق 2 مل من وسادة BSA بنسبة 15٪ لإزالة حطام المايلين. وسادة 2 مل فعالة لفأرين ، و 3 مل فعالة لأربعة فئران.
- للطبقات ، ضع 2 مل من BSA في الأنبوب ، وأغلقه ، وقم بتغطية جوانب الأنبوب برفق باستخدام BSA. بعد ذلك ، ضع طبقة برفق على تعليق الخلية من الأعلى ، عن طريق السحب على جانب الأنبوب.
- جهاز طرد مركزي في درجة حرارة الغرفة عند 300 × جم لمدة 10 دقائق (تسارع بطيء وتباطؤ). استخدم ماصة P1000 لإزالة السائل الصافي في الأعلى ، ومرحلة المايلين بينهما ، و BSA ، 1 مل في المرة الواحدة (تغيير الأطراف بين كل مل). اترك ~ 100 ميكرولتر من BSA حتى لا تزعج الحبيبات.
- أضف 5 مل من المخزن المؤقت للتحريك واحتضان الأنبوبفي حاضنة CO 2 37 درجة مئوية 37 درجة مئوية لمدة 30-45 دقيقة. هذا يسمح لاسترجاع المستضد. تأكد من فك الغطاء للسماح بتبادل الغازات.
- اغسل طبق CD45 ثلاث مرات باستخدام D-PBS. صب قبالة شطف النهائي. صب تعليق الخلية في طبق CD45.
- احتضان الخلايا على طبق CD45 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مع الدوران برفق عند نقطة 10 دقائق للسماح للخلايا بالوصول المتساوي إلى الجسم المضاد.
- شطف طبق PDGFRβ ثلاث مرات مع D-PBS وسكب شطف النهائي. انقل الخلايا غير المنضمة من طبق CD45 إلى طبق PDGFRβ.
- هز طبق CD45 برفق وادعمه بزاوية. ماصة بلطف 1 مل من تعليق الخلية فوق الطبق لجمع الخلايا غير المنضمة. صبها في طبق PDGFRβ والماصة لنقل تعليق الخلية المتبقي إلى لوحة PDGFRβ.
- احتضان لوحة PDGFRβ لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، مع الدوران برفق عند نقطة 10 دقائق للسماح للخلايا بالوصول المتساوي إلى الجسم المضاد.
- شطف طبق O4 ثلاث مرات مع D-PBS وسكب شطف النهائي. انقل الخلايا غير المنضمة من طبق PDGFRβ إلى طبق O4 باستخدام نفس الطريقة كما في الخطوة 3.2.19. احتضان لوحة O4 لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، والدوران برفق عند نقطة 10 دقائق للسماح للخلايا بالوصول المتساوي إلى الجسم المضاد.
- انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وجهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق عند 300 × جم. أعد تعليق الخلايا بالحجم المطلوب ، وقم بتخفيف 1: 1 باستخدام التريبان الأزرق لصلاحية الخلية. عد الخلايا المتوسطة إلى الكبيرة باستخدام مقياس الدم (سيسمح ذلك بأفضل تمثيل لعدد الخلايا العصبية في الثقافة).
- إزالة laminin ولوحة الخلايا في الكثافة المطلوبة. لا تترك اللوحة تجف بين إزالة اللامينين والطلاء ، وأضف الخلايا على الفور.
- استزراع الخلايا الكمية لإثراء الخلايا العصبية (الشكل 3) مع 500 خلية عصبية في 25 ميكرولتر من وسط المزرعة (الموصوف في 1.2.7) لكل بئر في 24 لوحة بئر واحتضانها عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. إغراق الآبار إلى حجم نهائي يبلغ 500 ميكرولتر.
- اليوم 4: تثبيت الكيمياء المناعية (ICC) ، والحجب ، والابتدائي
- بعد 48 ساعة من النمو ، أضف 500 ميكرولتر / بئر (أو حجم مكافئ للوسائط في البئر) من 8٪ PFA لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا. إذا كان تحليل الوسائط مطلوبا ، فيمكن للمرء أن يصلح بنسبة 4٪ PFA مباشرة. ومع ذلك ، لم نختبر هذا.
- اغسل الخلايا باستخدام D-PBS ثلاث مرات. لاحظ أننا احتفظنا بهذه الخلايا في الثقافة دون تغيير الوسائط لمدة أقصاها 72 ساعة ، لكننا نفترض أنها يمكن أن تعيش لفترة أطول ، خاصة إذا تم تغيير الوسائط إلى نصفها.
- قم بإزالة الغسيل النهائي وأضف محلول مانع كاف لكل بئر لتغطية الخلايا بالكامل. يحجب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة محلول الحجب وإضافة الجسم المضاد الأساسي في محلول الأجسام المضادة: β3-tubulin عند تخفيف 1: 1,000. أغلق اللوحة بغشاء شفاف واحتضانها طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
ملاحظة: قد يفكر المرء في تلطيخ PDGFRβ لغياب الخلايا الليفية ، CD45 لغياب الخلايا المناعية ، P0 أو PMP22 لغياب المايلين ، أو fabp7 للخلايا الدبقية الساتلية.
- يوم 5: ICC الثانوية
- اغسل الخلايا باستخدام D-PBS ثلاث مرات. قم بإزالة الغسيل النهائي وإضافة الأجسام المضادة الثانوية في محلول الأجسام المضادة: مضاد للأرانب 488 عند تخفيف 1: 500 و DAPI عند تخفيف 1: 2,000. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، محمية من الضوء.
- يغسل مع D-PBS ثلاث مرات. أضف ما يكفي من D-PBS لتغطية قاع البئر والصورة. يمكن ختم اللوحة بغشاء شفاف ، محمي من الضوء ، وتخزينها في 4 °C لمدة تصل إلى 2 أسابيع.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ثم تم تصوير الخلايا الثابتة الملطخة ب DAPI و β3-tubulin بنظام فحص عالي المحتوى متحد البؤر. تم تحليل الصور باستخدام برنامج تجاري مناسب لتحديد النسبة المئوية للخلايا الإيجابية ل DAPI التي تم تصنيفها بشكل مشترك مع β3-tubulin (الشكل 3). تم تحديد مزارع DRG الكاملة على أنها تحتوي على 42.36٪ ± 6.4٪ تلطيخ β3-tubulin ، وتم تحديد مزارع DRG المناعية بنسبة 71.44٪ ±7.43٪ β3-tubulin. هذا يكشف عن زيادة كبيرة في إثراء الخلايا العصبية مع immunopanning (p < 0.0001 ، اختبار t غير المزاوج).
الشكل 1: أساسيات المناعة. يتم لصق جسم مضاد ثانوي بطبق مزرعة بين عشية وضحاها ، ثم يتم إدخال الأجسام المضادة الأولية. وهذا يسمح بربط الخلايا محل الاهتمام باللوحة بواسطة مولد ضد سطحي. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: مناعية الخلايا العصبية DRG للفأر البالغ عن طريق الانتقاء السلبي. يتم حصاد DRGs وفصلها وتصفيتها في محلول خلية واحدة. تتم إزالة حطام المايلين عن طريق الطرد المركزي من خلال وسادة BSA. ثم يتم تمرير تعليق الخلية عبر ثلاثة أطباق مناعية (CD45 و PDGFRβ و O4) لتحقيق ثقافة غنية للخلايا العصبية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إثراء الخلايا العصبية في ثقافة DRG عن طريق المناعة. تم تلطيخ الثقافات الثابتة ب β3-tubulin للخلايا العصبية ، و DAPI لجميع النوى. (أ) صورة تمثيلية لثقافة كاملة (غير مناعية). (ب) صورة تمثيلية لثقافة مناعية. (ج) القياس الكمي للخلايا الإيجابية للتوبولين β3 كنسبة مئوية من إجمالي الخلايا الإيجابية ل DAPI. تشير الأشرطة إلى متوسط ± متوسط الخطأ القياسي (SEM). = p < 0.0001 ، اختبار t غير مزاوج. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يزيد بروتوكول المناعة هذا من نسبة الخلايا العصبية في الثقافات الأولية DRG. للحصول على أفضل النتائج ، يجب إجراء التشريح في الوقت المناسب ، ويجب تقليم DRGs من الأعصاب الزائدة. يجب مراقبة خطوة التفكك بعناية ، ويجب ألا تتجاوز 1 ساعة ، لمنع الخلايا من الإجهاد غير الضروري. فيما يتعلق بالمناعة على وجه التحديد ، يجب تدوير كل لوحة برفق في منتصف الطريق للسماح للخلايا بالوصول إلى الأجسام المضادة المغلفة. يجب أيضا عرض الألواح تحت مجهر الثقافة بعد جمع تعليق الخلايا العصبية للتأكد من أن الخلايا غير العصبية قد ارتبطت.
القيود في استخدام الفئران البالغة هي الطبيعة الثابتة ل DRGs. عدم القدرة على إزالة جميع أنواع الخلايا غير العصبية يترك ما يقرب من 30 ٪ من الثقافة غير عصبية (الشكل 3). بينما يمكننا فصل وتقليل عدد الخلايا المناعية والخلايا الليفية وخلايا شوان من الثقافات ، قد يكون من الصعب للغاية فصل الخلايا الدبقية التابعة عن الخلايا العصبية. نفترض أيضا أن هذه الخلايا العصبية يمكن أن يكون لها بقاء ضعيف بدون الدعم الأيضي الذي يوفره القمر الصناعي الدبقية10. بينما فشلت محاولتنا لتلطيخ هذه الخلايا باستخدام GFAP بسبب ضعف خصوصية الأجسام المضادة ، قد يكون الاتجاه المستقبلي هو تلطيخ هذه الخلايا باستخدام fabp7. حاولنا إزالة الخلايا غير العصبية الإيجابية CD9 مثل الخلايا الدبقية عبر الأقمار الصناعية عند استكشاف أخطاء هذا البروتوكول وإصلاحها. ومع ذلك ، في لوحة CD9 ، وجد أن العديد من الخلايا العصبية كانت مرتبطة باللوحة. نفترض أن الخلايا العصبية للفأر قد يكون لها بعض تعبير CD9. في الواقع ، تستخدم أدبيات الحويصلة خارج الخلية من الخلايا الشبيهة بالخلايا العصبية للفأر CD9 كعلامة11. إذا كان من الممكن العثور على جسم مضاد أكثر ملاءمة لتقليل نسبة الخلايا الدبقية الساتلية ، فقد يفكر المرء في مكملات إضافية مع عوامل النمو مثل NGF أو BDNF أو NT3 لمواجهة فقدان هذه الخلايا الداعمة.
يمكن لبروتوكول المناعة هذا تحسين دقة قراءات الخلايا العصبية من عينات زراعة DRG المتجانسة عن طريق زيادة نسبة الخلايا العصبية في الثقافة. كما أنه يوفر وسيلة لثقافة الخلايا العصبية DRG للفأر البالغ ، مما يسمح بإجراء تحقيق متعمق في الأنماط الظاهرية العصبية في نماذج الفئران الوراثية والمرضية والإصابة.
Immunopanning هو أيضا أداة قابلة للتخصيص بدرجة كبيرة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام علامة سطح الخلية isolectin-B4 لاختيار مستقبلات مسبب للألم للفأر غير الببتيدرجي على وجه التحديد. يمكن أيضا استخدام Immunopanning لإثراء الثقافات الأولية الأخرى ، بما في ذلك الخلايا العصبية القشرية ، والخلايا الدبقية الصغيرة ، والخلايا النجمية ، وخلايا سلائف oligodendrocyte. إنها أداة قوية يمكنها توسيع تطبيقات مزارع الخلايا الأولية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح للإعلان عنه.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منحة مشروع من المعاهد الكندية للبحوث الصحية (FRN-162434) ومنحة اكتشاف من جمعية التصلب المتعدد الكندية (EGID-3761). يود المؤلفون أن يشكروا الدكتور صن ومعهد الصليب للسرطان على التدريب واستخدام نظام ImageXpress.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 um Syringe filters | Fisher | 723-2520 | |
| 100 mm petri dishes | ThermoFisher | FB0875712 | |
| 24 well black glass-bottom plates | Cellvis | P24-1.5H-N | |
| 70 um cell strainer | Cedarlane | 15-1070-1(BI) | |
| B27+ supplement | Gibco | A3582801 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A7906 | for 15% BSA cushion, and ICC (heat shock fraction ≥98%) |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A4161 | for 4% BSA for immunopanning, and SATO for media (essentially globulin free, suitable for cell culture, ≥99%) |
| CD45 antibody | BD Pharmigen | 550539 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| DMEM | Gibco | 11960069 | |
| DNAse | Worthington | LS002007 | for stemxyme solution and panning buffer |
| D-PBS | Sigma Aldrich | D8662 | |
| EBSS | Sigma Aldrich | E6267 | for DNAse solution |
| Filter paper P8 grade | ThermoFisher | 09-795K | for 8% PFA |
| Glutamax | ThermoFisher | 35050061 | |
| goat-anti-mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-020 | for O4 dish |
| goat-anti-rabbit 488 | Invitrogen | A11008 | |
| goat-anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-003 | for PDGFRB dish |
| goat-anti-rat IgG | Jackson Immunoresearch | 115-005-044 | for CD45 dish |
| HBSS -/- | Sigma Aldrich | 14175145 | |
| Insulin | Sigma Aldrich | I2643 | |
| laminin | Invitrogen | 23017-015 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma Aldrich | A8199 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| Normal Donkey Serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| O4 antibody | n/a | n/a | Hybridoma |
| Ovomucoid trypsin inhibitor | Cedarlane | LS003086 | for low ovo |
| paraformaldehyde prills | Sigma Aldrich | 441244 | for 8% PFA |
| PDGFRB antibody | Abcam | AB32570 | |
| penicillin/ streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma Aldrich | P6407 | |
| Progesterone | Sigma Aldrich | P8783 | for SATO |
| Putrescine dihydrochrloride | Sigma Aldrich | P5780 | for SATO |
| Sodium phosphate dibasic | Fisher | S374-1 | for 0.2 M PB |
| Sodium Phosphate monobasic dihydrate | Sigma Aldrich | 04269 | for 0.2 M PB |
| Sodium Pyruvate | ThermoFisher | 11360070 | |
| Sodium Selenite | Sigma Aldrich | S5261 | for SATO |
| Stemxyme I | Cedarlane | LS004107 | for tissue dissociation; combination collagenase |
| Transferrin | Sigma Aldrich | T1147 | for SATO |
| Tris-HCl | Millipore Sigma | T5941 | |
| trypan blue | Gibco | 15250-061 | |
| β3-Tubulin | Sigma-Aldrich | T2200 |
References
- Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D.
- Perner, C., Sokol, C. L. Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release. STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).
- Lin, Y. T., Chen, J. C. Dorsal root ganglia isolation and primary culture to study neurotransmitter release. Journal of Visualized Experiments:JoVE. (140), e57569 (2018).
- Foo, L. C., et al. Development of a method for the purification and culture of rodent astrocytes. Neuron. 71 (5), 799-811 (2011).
- Nolle, A., et al. Enrichment of Glial Cells From Human Post-mortem Tissue for Transcriptome and Proteome Analysis Using Immunopanning. Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 772011 (2021).
- Barres, B. A. Designing and troubleshooting immunopanning protocols for purifying neural cells. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (12), 1342-1347 (2014).
- Zuchero, J. B. Purification of dorsal root ganglion neurons from rat by immunopanning. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (8), 826-838 (2014).
- Sommer, I., Schachner, M. Monoclonal antibodies (O1 to O4) to oligodendrocyte cell surfaces: an immunocytological study in the central nervous system. Developmental Biology. 83 (2), 311-327 (1981).
- Sommer, I., Schachner, M. Cell that are O4 antigen-positive and O1 antigen-negative differentiate into O1 antigen-positive oligodendrocytes. Neuroscience Letters. 29 (2), 183-188 (1982).
- Hanani, M. Satellite glial cells in sensory ganglia: from form to function. Brain Research. Brain Research Reviews. 48 (3), 457-476 (2005).
- Viveiros, A., et al. In-cell labeling coupled to direct analysis of extracellular vesicles in the conditioned medium to study extracellular vesicles secretion with minimum sample processing and particle loss. Cells. 11 (3), 351 (2022).
