Modello murino spontaneo di carcinoma anaplastico della tiroide
Summary
Qui, presentiamo una pipeline standard per ottenere tumori ATC murini da modelli murini di topi geneticamente modificati. Inoltre, presentiamo dinamiche tumorali e informazioni patologiche sulle lesioni primarie e metastatizzate. Questo modello aiuterà i ricercatori a comprendere la tumorigenesi e facilitare le scoperte di farmaci.
Abstract
Il carcinoma anaplastico della tiroide (ATC) è un tumore maligno raro ma letale con una prognosi infausta. Vi è un urgente bisogno di ricerche più approfondite sulla cancerogenesi e lo sviluppo dell’ATC, nonché sui metodi terapeutici, poiché i trattamenti standard sono essenzialmente esauriti nei pazienti con ATC. Tuttavia, la bassa prevalenza ha ostacolato studi clinici approfonditi e la raccolta di campioni di tessuto, quindi sono stati raggiunti pochi progressi nella creazione di trattamenti efficaci. Abbiamo usato l’ingegneria genetica per creare un modello murino ATC condizionatamente inducibile (mATC) in uno sfondo C57BL / 6. Il modello murino ATC è stato genotipizzato mediante TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 e indotto mediante iniezione intraperitoneale con tamoxifene. Con il modello murino, abbiamo studiato la dinamica del tumore (la dimensione del tumore variava da 12,4 mm 2 a 32,5 mm2 dopo 4 mesi di induzione), la sopravvivenza (il periodo di sopravvivenza mediano era di 130 giorni) e le metastasi (metastasi polmonari si sono verificate nel 91,6% dei topi) le curve e le caratteristiche patologiche (caratterizzate da Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 e Caspasi-3 colorazione immunoistochimica). I risultati hanno indicato che il mATC spontaneo possiede dinamiche tumorali e microambiente immunologico altamente simili ai tumori ATC umani. In conclusione, con un’elevata somiglianza nelle caratteristiche fisiopatologiche e nei genotipi unificati, il modello mATC ha risolto in una certa misura la carenza di tessuto ATC clinico e l’eterogeneità del campione. Pertanto, faciliterebbe il meccanismo e gli studi traslazionali dell’ATC e fornirebbe un approccio per studiare il potenziale di trattamento di piccoli farmaci molecolari e agenti immunoterapici per ATC.
Introduction
Il cancro della tiroide è una delle neoplasie endocrine più comuni1, originata dall’epitelio tiroideo. Negli ultimi anni, l’incidenza del cancro alla tiroide è aumentata rapidamente in tutto il mondo2. Il cancro della tiroide può essere suddiviso in tipi distinti in base al grado di differenziazione delle cellule tumorali. Sulla base del comportamento clinico e dell’istologia, i carcinomi tiroidei si dividono in carcinomi ben differenziati, tra cui carcinoma papillare della tiroide (PTC) e carcinoma follicolare della tiroide (FTC), carcinoma scarsamente differenziato (PDTC) e carcinoma indifferenziato o anaplastico della tiroide (ATC)3. A differenza del PTC, che è un tipo comune con comportamento lieve e prognosi migliore4, l’ATC è un tumore maligno raro e altamente aggressivo che rappresenta dal 2% al 3% di tutti i tumori della tiroide5. Sebbene l’ATC sia raro, è responsabile di circa il 50% dei decessi correlati al cancro della tiroide, con una triste sopravvivenza (6-8 mesi)6,7. Oltre il 50% dei casi di ATC viene diagnosticato come metastasi polmonare8. Oltre alla natura aggressiva dell’ATC, nella clinica è stato sviluppato un trattamento efficace limitato. Pertanto, i pazienti ATC hanno una prognosi infausta 9,10,11. Ciò suggerisce che sono urgentemente necessari ulteriori studi approfonditi sui meccanismi molecolari alla base dello sviluppo dell’ATC e del trattamento.
La tumorigenesi dell’ATC è un processo dinamico dedifferenziato. La difficoltà di raccogliere campioni di tumore umano in ogni fase degli studi clinici ha ostacolato la comprensione del meccanismo di sviluppo dai carcinomi ben differenziati a quelli indifferenziati. Al contrario, l’uso di modelli ATC murini (mATC) favorisce la raccolta di campioni mATC nell’intero corso di tumorigenesi. Pertanto, possiamo comprendere meglio i meccanismi di formazione del tumore analizzando il processo dinamico dedifferenziato. Inoltre, l’eterogeneità dei campioni clinici di ATC ha anche contribuito alla difficoltà di comprensione del meccanismo molecolare. Tuttavia, i topi condividevano gli stessi background genetici e sono stati mantenuti in ambienti di vita simili, garantendo la consistenza di ciascun tumore. Ciò facilita l’esplorazione del ruolo generalizzato dello sviluppo ATC12,13,14. Inoltre, mATC è un modello tumorale in situ che può ripristinare l’influenza della posizione anatomica e del microambiente tessuto-specifico. Come tale, rispetto ai topi immunodeficienti comunemente usati, mATC è un modello murino spontaneo con un sistema immunitario intatto e un microambiente immunitario.
Pertanto, abbiamo costruito mATC indotto condizionatamente con il ceppo C57BL / 6, che è un modello murino in grado di riprodurre le caratteristiche patologiche del carcinoma tiroideo dedifferenziato. Sulla base di questo modello, abbiamo fornito una breve panoramica delle basi molecolari, delle idee costruttive, delle caratteristiche patologiche e delle applicazioni di mATC. Inoltre, abbiamo osservato e riportato la crescita tumorale, il tempo di sopravvivenza, le metastasi e le caratteristiche patologiche di mATC. Riteniamo che questa sarà una panoramica informatica per aiutare altri ricercatori a utilizzare questo modello più facilmente.
Abbiamo costruito un modello mATC inducibile condizionale, come riportato per la prima volta da McFadden15; inizialmente, abbiamo costruito topi: TPO-cre / ERT2, Braf flox / wt e Trp53flox / wt. In particolare, i topi TPO-cre / ERT2 includevano il promotore della perossidasi tiroidea umana (TPO) (un promotore specifico della tiroide), guidando l’espressione di un gene di fusione cre-ERT2 (una cre ricombinasi fusa a un dominio di legame del ligando del recettore degli estrogeni umano). Cre-ERT2 è solitamente confinato al citoplasma ed entra nel nucleo solo quando esposto al tamoxifene, che induce cre ad esercitare attività enzimatica ricombinante. Quando i topi sono incrociati con topi portatori di sequenze affiancate da loxP, dopo l’induzione del tamoxifene, la ricombinazione cre-mediata elimina le sequenze floxate nelle cellule tiroidee per raggiungere lo scopo di knocking out o knocking in geni specifici.
Inoltre, i topi Braf flox/wt sono un allele knock-in di Braf umano basato sul sistema cre-loxP. Il trascritto murino Brafflox/wt è codificato dagli esoni endogeni 1-14 e dagli esoni umani 15-18 fiancheggiati da loxP. Dopo l’escissione cre-mediata delle regioni floxate, l’esone mutante 15 (modificato con una sostituzione aminoacidica V600E legata a BrafV600E costitutivamente attivo nei tumori umani) e gli esoni endogeni 16-18 vengono utilizzati per generare i trascritti. Inoltre, i topi Trp53 flox/wt sono alleli knockout di Trp53 umano e hanno siti loxP che fiancheggiano gli esoni 2-10 di Trp53. Quando incrociata con topi con una cre ricombinasi, la ricombinazione cre-mediata elimina la sequenza floxata per mettere fuori combattimento Trp53. Quindi, i topi TPO-cre/ERT2, Braf flox/w e Trp53flox/wt sono stati incrociati per ottenere TB (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) topi e TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt; Trp53flox/wt) topi, che potrebbero essere utilizzati per generare PTC e ATC. Dopo circa 8 settimane, i topi sono stati indotti da una somministrazione intraperitoneale (i.p.) di 150 mg / kg di tamoxifene sciolto in olio di mais per due somministrazioni. La crescita del tumore potrebbe essere monitorata mediante ecografia ad alta frequenza (il primo punto temporale dell’ecografia è stato registrato come Giorno 0). L’ecografia iniziale è stata eseguita 40 giorni dopo l’introduzione del tamoxifene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passaggi critici all’interno del protocollo per la dissezione del tumore tiroideo
Durante la dissezione, la posizione anatomica della ghiandola tiroidea deve essere compresa correttamente. La ghiandola tiroidea è una ghiandola a forma di farfalla situata sul lato dorsale della ghiandola sottomandibolare vicino alla cartilagine tiroidea e alla trachea. Durante la procedura, recidere le arterie del sangue su entrambi i lati del collo è stato accuratamente evitato.
M…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research Development Program of China (2021YFA1301203); la National Natural Science Foundation of China (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); il Clinical Research Incubation Project, West China Hospital, Sichuan University (22HXFH019); il progetto di cooperazione internazionale dell’Ufficio municipale di scienza e tecnologia di Chengdu (2020-GH02-00017-HZ); Fondazione di Scienze Naturali del Sichuan, 2022NSFSC1314; il “Progetto 1.3.5 per discipline di eccellenza, West China Hospital, Sichuan University” (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); e Programma di scienza e tecnologia del Sichuan (2023YFS0098).
Materials
| 100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
| 50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
| CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
| CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
| Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
| F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
| Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
| Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
| Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
| HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
| Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
| Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
| SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
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