Hier stellen wir eine Standard-Pipeline vor, um murine ATC-Tumore durch spontane gentechnisch veränderte Mausmodelle zu erhalten. Des Weiteren präsentieren wir die Tumordynamik und pathologische Informationen über die primären und metastasierten Läsionen. Dieses Modell wird den Forschern helfen, die Tumorentstehung zu verstehen und die Entdeckung von Medikamenten zu erleichtern.
Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist eine seltene, aber tödliche bösartige Erkrankung mit einer düsteren Prognose. Es besteht ein dringender Bedarf an tiefergehender Forschung zur Karzinogenese und Entwicklung von ATC sowie zu therapeutischen Methoden, da die Standardbehandlungen bei ATC-Patienten im Wesentlichen erschöpft sind. Die geringe Prävalenz hat jedoch gründliche klinische Studien und die Entnahme von Gewebeproben behindert, so dass bei der Entwicklung wirksamer Behandlungen nur geringe Fortschritte erzielt wurden. Mit Hilfe der Gentechnik haben wir ein bedingt induzierbares ATC-Mausmodell (mATC) in einem C57BL/6-Hintergrund erstellt. Das ATC-Mausmodell wurde mittels TPO-cre/ERT2 genotypisiert; BrafCA/wt; Trp53 ex2-10/ex2-10 und durch intraperitoneale Injektion mit Tamoxifen induziert. Mit dem Mausmodell untersuchten wir die Tumordynamik (die Tumorgröße reichte von 12,4 mm2 bis 32,5mm2 nach 4 Monaten Induktion), das Überleben (die mediane Überlebenszeit betrug 130 Tage) und die Metastasierung (Lungenmetastasen traten bei 91,6% der Mäuse auf) und pathologische Merkmale (charakterisiert durch immunhistochemische Färbung von Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 und Caspase-3). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das spontane mATC eine sehr ähnliche Tumordynamik und immunologische Mikroumgebung wie humane ATC-Tumore aufweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das mATC-Modell mit hoher Ähnlichkeit in pathophysiologischen Merkmalen und einheitlichen Genotypen den Mangel an klinischem ATC-Gewebe und Probenheterogenität bis zu einem gewissen Grad auflöste. Daher würde es den Mechanismus und die translationalen Studien von ATC erleichtern und einen Ansatz zur Untersuchung des Behandlungspotenzials von niedermolekularen Medikamenten und Immuntherapeutika für ATC bieten.
Schilddrüsenkrebs ist eine der häufigsten endokrinen Malignome1 und hat seinen Ursprung im Schilddrüsenepithel. In den letzten Jahren hat die Inzidenz von Schilddrüsenkrebs weltweit rapide zugenommen2. Schilddrüsenkrebs kann je nach Grad der Differenzierung der Tumorzellen in verschiedene Typen unterteilt werden. Auf der Grundlage des klinischen Verhaltens und der Histologie werden Schilddrüsenkarzinome in gut differenzierte Karzinome unterteilt, darunter das papilläre Schilddrüsenkarzinom (PTC) und das follikuläre Schilddrüsenkarzinom (FTC), das schlecht differenzierte Karzinom (PDTC) und das undifferenzierte oder anaplastische Karzinom der Schilddrüse (ATC)3. Im Gegensatz zur PTC, die eine häufige Form mit mildem Verhalten und besserer Prognose ist 4,ist die ATC eine seltene und hochaggressive bösartige Erkrankung, die 2 % bis 3 % aller Schilddrüsentumoren ausmacht5. Obwohl ATC selten ist, ist es für etwa 50 % der Todesfälle im Zusammenhang mit Schilddrüsenkrebs verantwortlich, mit einer düsteren Überlebensrate (6-8 Monate)6,7. Über 50 % der ATC-Fälle werden als Lungenmetastasen diagnostiziert8. Zusätzlich zu der aggressiven Natur der ATC wurde in der Klinik eine begrenzt wirksame Behandlung entwickelt. Daher haben ATC-Patienten eine düstere Prognose 9,10,11. Dies deutet darauf hin, dass weitere eingehende Studien zu den molekularen Mechanismen, die der Entwicklung von ATC und der Behandlung zugrunde liegen, dringend erforderlich sind.
Die Tumorgenese der ATC ist ein dynamischer dedifferenzierter Prozess. Die Schwierigkeit, menschliche Tumorproben in jedem Stadium klinischer Studien zu entnehmen, hat das Verständnis des Entstehungsmechanismus von gut differenzierten zu undifferenzierten Karzinomen erschwert. Im Gegensatz dazu begünstigt die Verwendung von murinen ATC-Modellen (mATC) die Entnahme von mATC-Proben im gesamten Tumorentstehungsverlauf. Daher können wir die Mechanismen der Tumorentstehung besser verstehen, indem wir den dynamischen dedifferenzierten Prozess analysieren. Darüber hinaus hat auch die Heterogenität der klinischen ATC-Proben dazu beigetragen, dass es schwierig ist, den molekularen Mechanismus zu verstehen. Nichtsdestotrotz hatten die Mäuse den gleichen genetischen Hintergrund und wurden in ähnlichen Lebensumgebungen gehalten, um die Konsistenz jedes Tumors zu gewährleisten. Dies erleichtert die Untersuchung der verallgemeinerten Rolle der ATC-Entwicklung12,13,14. Darüber hinaus ist mATC ein In-situ-Tumormodell, das den Einfluss der anatomischen Lokalisation und der gewebespezifischen Mikroumgebung wiederherstellen kann. Im Vergleich zu häufig verwendeten immundefizienten Mäusen ist mATC ein spontanes Mausmodell mit einem intakten Immunsystem und einer immunen Mikroumgebung.
Daher haben wir mit dem Stamm C57BL/6 eine bedingt induzierte mATC konstruiert, die in der Lage ist, die pathologischen Merkmale eines dedifferenzierten Schilddrüsenkarzinoms zu reproduzieren. Basierend auf diesem Modell gaben wir einen kurzen Überblick über die molekularen Grundlagen, Konstruktionsideen, pathologischen Eigenschaften und Anwendungen von mATC. Darüber hinaus beobachteten und berichteten wir über Tumorwachstum, Überlebenszeit, Metastasierung und pathologische Merkmale von mATC. Wir glauben, dass dies ein informatischer Überblick sein wird, um anderen Forschern zu helfen, dieses Modell einfacher zu verwenden.
Wir konstruierten ein bedingt induzierbares mATC-Modell, wie zuerst von McFadden15 beschrieben; Zunächst konstruierten wir Mäuse: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt und Trp53flox/wt. Konkret enthielten TPO-cre/ERT2-Mäuse den humanen Schilddrüsenperoxidase (TPO)-Promotor (ein schilddrüsenspezifischer Promotor), der die Expression eines cre-ERT2-Fusionsgens (eine cre-Rekombinase, die mit einer humanen Östrogenrezeptor-Liganden-Bindungsdomäne fusioniert) antreibt. Cre-ERT2 ist in der Regel auf das Zytoplasma beschränkt und dringt nur dann in den Zellkern ein, wenn es Tamoxifen ausgesetzt wird, das cre dazu veranlasst, rekombinante Enzymaktivität auszuüben. Wenn die Mäuse mit Mäusen gekreuzt werden, die loxP-flankierte Sequenzen tragen, werden nach der Tamoxifen-Induktion durch cre-vermittelte Rekombination die gefloxten Sequenzen in den Schilddrüsenzellen gelöscht, um den Zweck zu erreichen, bestimmte Gene auszuschalten oder einzuschalten.
Darüber hinaus sind Braf flox/wt-Mäuse ein Knock-in-Allel des menschlichen Braf, das auf dem cre-loxP-System basiert. Das murineBraf-Flox/wt-Transkript wird von endogenen Exons 1-14 und loxP-flankierten humanen Exons 15-18 kodiert. Nach der cre-vermittelten Exzision der gefloxten Regionen werden das mutierte Exon 15 (modifiziert mit einer V600E-Aminosäuresubstitution, die mit konstitutiv aktivem BrafV600E in humanen Karzinomen verknüpft ist) und die endogenen Exons 16-18 zur Generierung der Transkripte verwendet. Darüber hinaus sind Trp53 flox/wt Mäuse Knockout-Allele von humanem Trp53 und haben loxP-Stellen, die die Exons 2-10 von Trp53 flankieren. Bei der Kreuzung mit Mäusen mit einer cre-Rekombinase wird durch die cre-vermittelte Rekombination die gefloxte Sequenz gelöscht, um Trp53 auszuschalten. Anschließend wurden TPO-cre/ERT2-, Braf flox/w- und Trp53flox/wt-Mäuse gekreuzt, um TB zu erhalten (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt) Mäuse und TBP (TPO-cre/ERT2; Brafflox/wt; Trp53flox/wt) Mäuse, die zur Erzeugung von PTC und ATC verwendet werden könnten. Nach ca. 8 Wochen wurden die Mäuse durch eine intraperitoneale (i.p.) Verabreichung von 150 mg/kg Tamoxifen, gelöst in Maisöl, für zwei Verabreichungen induziert. Das Tumorwachstum konnte mittels Hochfrequenz-Ultraschall überwacht werden (der erste Zeitpunkt der Sonographie wurde als Tag 0 aufgezeichnet). Die erste Sonographie wurde 40 Tage nach der Einführung von Tamoxifen durchgeführt.
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls für die Dissektion von Schilddrüsentumoren
Während der Dissektion muss die anatomische Lage der Schilddrüse richtig verstanden werden. Die Schilddrüse ist eine schmetterlingsförmige Drüse, die sich auf der dorsalen Seite der Unterkieferdrüse in der Nähe des Schildknorpels und der Luftröhre befindet. Während des Eingriffs wurde eine Durchtrennung der Blutarterien auf beiden Seiten des Halses sorgfältig vermieden.
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The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch das National Key Research Development Program of China (2021YFA1301203) unterstützt; die Nationale Naturwissenschaftliche Stiftung Chinas (82103031, 82103918, 81973408, 82272933); das Inkubationsprojekt für klinische Forschung, West China Hospital, Universität Sichuan (22HXFH019); das internationale Kooperationsprojekt des Chengdu Municipal Science and Technology Bureau (2020-GH02-00017-HZ); Naturwissenschaftliche Stiftung von Sichuan, 2022NSFSC1314; das “1.3.5-Projekt für Exzellenzdisziplinen, West China Hospital, Sichuan University” (ZYJC18035, ZYJC18025, ZYYC20003, ZYJC18003); und Sichuan Science and Technology Program (2023YFS0098).
100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0) | MXB | Cat# MVS-0101 | |
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5) | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9071 | |
Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
Caspase-3 | Beyotime | Cat# AC033 | |
CD8 | Cell Signaling Technology | Cat# 98941; RRID:AB_2756376 | |
CD206 | Cell Signaling Technology | Cat# 24595; RRID:AB_2892682 | |
Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
Enhanced DAB chromogenic kit | MXB | Cat# DAB-2031 | |
Eosin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9613 | |
F4/80 | Abcam | Cat# 100790; RRID:AB_10675322 | |
Foxp3 | Cell Signaling Technology | Cat# 12653; RRID:AB_2797979 | |
Fully enclosed tissue dehydrator | Leica Biosystems | ASP300S | |
Hematoxylin staining solution | ZSGB-GIO | Cat# ZLI-9610 | |
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine | Leica Biosystems | ||
Ki67 | Beyotime | Cat# AF1738 | |
Rotating Slicer | RWDlifescience | Minux S700 | |
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems) | ZSGB-GIO | Cat# SP-9001 | |
TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
Ultrasonic cell crusher | Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd | JY92-IIN | |
Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
Ultrasound system | VisualSonics | Vevo 3100 |