Spontanes Mausmodell des anaplastischen Schilddrüsenkarzinoms

Summary

Hier stellen wir eine Standard-Pipeline vor, um murine ATC-Tumore durch spontane gentechnisch veränderte Mausmodelle zu erhalten. Des Weiteren präsentieren wir die Tumordynamik und pathologische Informationen über die primären und metastasierten Läsionen. Dieses Modell wird den Forschern helfen, die Tumorentstehung zu verstehen und die Entdeckung von Medikamenten zu erleichtern.

Abstract

Das anaplastische Schilddrüsenkarzinom (ATC) ist eine seltene, aber tödliche bösartige Erkrankung mit einer düsteren Prognose. Es besteht ein dringender Bedarf an tiefergehender Forschung zur Karzinogenese und Entwicklung von ATC sowie zu therapeutischen Methoden, da die Standardbehandlungen bei ATC-Patienten im Wesentlichen erschöpft sind. Die geringe Prävalenz hat jedoch gründliche klinische Studien und die Entnahme von Gewebeproben behindert, so dass bei der Entwicklung wirksamer Behandlungen nur geringe Fortschritte erzielt wurden. Mit Hilfe der Gentechnik haben wir ein bedingt induzierbares ATC-Mausmodell (mATC) in einem C57BL/6-Hintergrund erstellt. Das ATC-Mausmodell wurde mittels TPO-cre/ERT2 genotypisiert; Braf^CA/wt; Trp53 ex2-10^/ex2-10 und durch intraperitoneale Injektion mit Tamoxifen induziert. Mit dem Mausmodell untersuchten wir die Tumordynamik (die Tumorgröße reichte von 12,4 mm2 bis 32,5^mm2 nach 4 Monaten Induktion), das Überleben (die mediane Überlebenszeit betrug 130 Tage) und die Metastasierung (Lungenmetastasen traten bei 91,6% der Mäuse auf) und pathologische Merkmale (charakterisiert durch immunhistochemische Färbung von Cd8, Foxp3, F4/80, Cd206, Ki67 und Caspase-3). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das spontane mATC eine sehr ähnliche Tumordynamik und immunologische Mikroumgebung wie humane ATC-Tumore aufweist. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das mATC-Modell mit hoher Ähnlichkeit in pathophysiologischen Merkmalen und einheitlichen Genotypen den Mangel an klinischem ATC-Gewebe und Probenheterogenität bis zu einem gewissen Grad auflöste. Daher würde es den Mechanismus und die translationalen Studien von ATC erleichtern und einen Ansatz zur Untersuchung des Behandlungspotenzials von niedermolekularen Medikamenten und Immuntherapeutika für ATC bieten.

Introduction

Schilddrüsenkrebs ist eine der häufigsten endokrinen Malignome¹ und hat seinen Ursprung im Schilddrüsenepithel. In den letzten Jahren hat die Inzidenz von Schilddrüsenkrebs weltweit rapide zugenommen². Schilddrüsenkrebs kann je nach Grad der Differenzierung der Tumorzellen in verschiedene Typen unterteilt werden. Auf der Grundlage des klinischen Verhaltens und der Histologie werden Schilddrüsenkarzinome in gut differenzierte Karzinome unterteilt, darunter das papilläre Schilddrüsenkarzinom (PTC) und das follikuläre Schilddrüsenkarzinom (FTC), das schlecht differenzierte Karzinom (PDTC) und das undifferenzierte oder anaplastische Karzinom der Schilddrüse (ATC)³. Im Gegensatz zur PTC, die eine häufige Form mit mildem Verhalten und besserer Prognose ist 4,^ist die ATC eine seltene und hochaggressive bösartige Erkrankung, die 2 % bis 3 % aller Schilddrüsentumoren ausmacht⁵. Obwohl ATC selten ist, ist es für etwa 50 % der Todesfälle im Zusammenhang mit Schilddrüsenkrebs verantwortlich, mit einer düsteren Überlebensrate (6-8 Monate)^6,7. Über 50 % der ATC-Fälle werden als Lungenmetastasen diagnostiziert⁸. Zusätzlich zu der aggressiven Natur der ATC wurde in der Klinik eine begrenzt wirksame Behandlung entwickelt. Daher haben ATC-Patienten eine düstere Prognose 9,10,11. Dies deutet darauf hin, dass weitere eingehende Studien zu den molekularen Mechanismen, die der Entwicklung von ATC und der Behandlung zugrunde liegen, dringend erforderlich sind.

Die Tumorgenese der ATC ist ein dynamischer dedifferenzierter Prozess. Die Schwierigkeit, menschliche Tumorproben in jedem Stadium klinischer Studien zu entnehmen, hat das Verständnis des Entstehungsmechanismus von gut differenzierten zu undifferenzierten Karzinomen erschwert. Im Gegensatz dazu begünstigt die Verwendung von murinen ATC-Modellen (mATC) die Entnahme von mATC-Proben im gesamten Tumorentstehungsverlauf. Daher können wir die Mechanismen der Tumorentstehung besser verstehen, indem wir den dynamischen dedifferenzierten Prozess analysieren. Darüber hinaus hat auch die Heterogenität der klinischen ATC-Proben dazu beigetragen, dass es schwierig ist, den molekularen Mechanismus zu verstehen. Nichtsdestotrotz hatten die Mäuse den gleichen genetischen Hintergrund und wurden in ähnlichen Lebensumgebungen gehalten, um die Konsistenz jedes Tumors zu gewährleisten. Dies erleichtert die Untersuchung der verallgemeinerten Rolle der ATC-Entwicklung^12,13,14. Darüber hinaus ist mATC ein In-situ-Tumormodell, das den Einfluss der anatomischen Lokalisation und der gewebespezifischen Mikroumgebung wiederherstellen kann. Im Vergleich zu häufig verwendeten immundefizienten Mäusen ist mATC ein spontanes Mausmodell mit einem intakten Immunsystem und einer immunen Mikroumgebung.

Daher haben wir mit dem Stamm C57BL/6 eine bedingt induzierte mATC konstruiert, die in der Lage ist, die pathologischen Merkmale eines dedifferenzierten Schilddrüsenkarzinoms zu reproduzieren. Basierend auf diesem Modell gaben wir einen kurzen Überblick über die molekularen Grundlagen, Konstruktionsideen, pathologischen Eigenschaften und Anwendungen von mATC. Darüber hinaus beobachteten und berichteten wir über Tumorwachstum, Überlebenszeit, Metastasierung und pathologische Merkmale von mATC. Wir glauben, dass dies ein informatischer Überblick sein wird, um anderen Forschern zu helfen, dieses Modell einfacher zu verwenden.

Wir konstruierten ein bedingt induzierbares mATC-Modell, wie zuerst von McFadden¹⁵ beschrieben; Zunächst konstruierten wir Mäuse: TPO-cre/ERT2, Braf flox/wt und Trp53^flox/wt. Konkret enthielten TPO-cre/ERT2-Mäuse den humanen Schilddrüsenperoxidase (TPO)-Promotor (ein schilddrüsenspezifischer Promotor), der die Expression eines cre-ERT2-Fusionsgens (eine cre-Rekombinase, die mit einer humanen Östrogenrezeptor-Liganden-Bindungsdomäne fusioniert) antreibt. Cre-ERT2 ist in der Regel auf das Zytoplasma beschränkt und dringt nur dann in den Zellkern ein, wenn es Tamoxifen ausgesetzt wird, das cre dazu veranlasst, rekombinante Enzymaktivität auszuüben. Wenn die Mäuse mit Mäusen gekreuzt werden, die loxP-flankierte Sequenzen tragen, werden nach der Tamoxifen-Induktion durch cre-vermittelte Rekombination die gefloxten Sequenzen in den Schilddrüsenzellen gelöscht, um den Zweck zu erreichen, bestimmte Gene auszuschalten oder einzuschalten.

Darüber hinaus sind Braf ^{flox/wt-Mäuse} ein Knock-in-Allel des menschlichen Braf, das auf dem cre-loxP-System basiert. Das murine^{Braf-Flox/wt-Transkript} wird von endogenen Exons 1-14 und loxP-flankierten humanen Exons 15-18 kodiert. Nach der cre-vermittelten Exzision der gefloxten Regionen werden das mutierte Exon 15 (modifiziert mit einer V600E-Aminosäuresubstitution, die mit konstitutiv aktivem Braf^V600E in humanen Karzinomen verknüpft ist) und die endogenen Exons 16-18 zur Generierung der Transkripte verwendet. Darüber hinaus sind Trp53 ^flox/wt Mäuse Knockout-Allele von humanem Trp53 und haben loxP-Stellen, die die Exons 2-10 von Trp53 flankieren. Bei der Kreuzung mit Mäusen mit einer cre-Rekombinase wird durch die cre-vermittelte Rekombination die gefloxte Sequenz gelöscht, um Trp53 auszuschalten. Anschließend wurden TPO-cre/ERT2-, Braf flox/w- und Trp53^{flox/wt-Mäuse gekreuzt}, um TB zu erhalten (TPO-cre^/ERT2; Braf^flox/wt) Mäuse und TBP (TPO-cre/ERT2; Braf^flox/wt; Trp53^flox/wt) Mäuse, die zur Erzeugung von PTC und ATC verwendet werden könnten. Nach ca. 8 Wochen wurden die Mäuse durch eine intraperitoneale (i.p.) Verabreichung von 150 mg/kg Tamoxifen, gelöst in Maisöl, für zwei Verabreichungen induziert. Das Tumorwachstum konnte mittels Hochfrequenz-Ultraschall überwacht werden (der erste Zeitpunkt der Sonographie wurde als Tag 0 aufgezeichnet). Die erste Sonographie wurde 40 Tage nach der Einführung von Tamoxifen durchgeführt.

Protocol

Die hier beschriebenen tierexperimentellen Eingriffe wurden mit Genehmigung der Tierethikkommission des West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan, China durchgeführt. 1. Induktion von TBP-Mäusen Identifizierung des Genotyps von MäusenTrennen Sie nach etwa 3 Wochen die weiblichen Mäuse von den männlichen Mäusen. Verwenden Sie gleichzeitig die Ohrmarkenklemme, um eine Ohrmarke zu befestigen. Platzieren Sie die Ohrmarken in der unteren Häl…

Representative Results

Wir induzierten mATC, um das Tumorwachstum, die Überlebenszeit der Maus und pathologische Eigenschaften zu untersuchen. Nach der Induktion wurden die Mäuse sofort getötet und Proben (Schilddrüse, Lunge und Leber) entnommen, sobald eine der folgenden Erkrankungen festgestellt wurde: 1) Atemnot durch Tumorkompression; 2) verminderter Appetit und abnorme Lautäußerungen; 3) ungewöhnliche Lethargie; und 4) Körpergewichtsverlust von über 20%. Während des Probenahmeprozesses stellten wir fest, dass alle Mäuse (12/12)…

Discussion

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls für die Dissektion von Schilddrüsentumoren
Während der Dissektion muss die anatomische Lage der Schilddrüse richtig verstanden werden. Die Schilddrüse ist eine schmetterlingsförmige Drüse, die sich auf der dorsalen Seite der Unterkieferdrüse in der Nähe des Schildknorpels und der Luftröhre befindet. Während des Eingriffs wurde eine Durchtrennung der Blutarterien auf beiden Seiten des Halses sorgfältig vermieden.

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Materials

100x Citrate antigen retrieval solution (PH 6.0)	MXB	Cat# MVS-0101
50x EDTA antigen retrieval solution(pH 9.5)	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9071
Brafflox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Caspase-3	Beyotime	Cat# AC033
CD8	Cell Signaling Technology	Cat# 98941; RRID:AB_2756376
CD206	Cell Signaling Technology	Cat# 24595; RRID:AB_2892682
Chamber for anesthesia induction	RWDlifescience
Enhanced DAB chromogenic kit	MXB	Cat# DAB-2031
Eosin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9613
F4/80	Abcam	Cat# 100790; RRID:AB_10675322
Foxp3	Cell Signaling Technology	Cat# 12653; RRID:AB_2797979
Fully enclosed tissue dehydrator	Leica Biosystems	ASP300S
Hematoxylin staining solution	ZSGB-GIO	Cat# ZLI-9610
HistoCore Arcadia fully automatic tissue embedding machine	Leica Biosystems
Ki67	Beyotime	Cat# AF1738
Rotating Slicer	RWDlifescience	Minux S700
SPlink detection kits (Biotin-Streptavidin HRP Detection Systems)	ZSGB-GIO	Cat# SP-9001
TPO-cre/ERT2 mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Trp53flox/wt mice	Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China
Ultrasonic cell crusher	Ningbo Xinyi Ultrasound Equipment Co., Ltd	JY92-IIN
Ultrasound gel	Keppler	KL-250
Ultrasound system	VisualSonics	Vevo 3100