Summary
Este artigo descreve um novo método para estudar o comportamento miccional de camundongos incorporando o monitoramento de vídeo no ensaio convencional de ponto vazio. Essa abordagem fornece informações temporais, espaciais e volumétricas sobre os eventos miccionais e detalhes do comportamento do camundongo durante as fases clara e escura do dia.
Abstract
O comportamento miccional normal é o resultado da função coordenada da bexiga, da uretra e dos esfíncteres uretrais sob o controle adequado do sistema nervoso. Para estudar o comportamento miccional voluntário em modelos de camundongos, os pesquisadores desenvolveram o void spot assay (VSA), um método que mede o número e a área de manchas de urina depositadas em um papel de filtro que reveste o chão da gaiola de um animal. Embora tecnicamente simples e barato, este ensaio apresenta limitações quando usado como um ensaio de desfecho, incluindo a falta de resolução temporal dos eventos miccionais e dificuldades em quantificar manchas de urina sobrepostas. Para superar essas limitações, desenvolvemos um VSA videomonitorado, que chamamos de VSA em tempo real (RT-VSA), e que nos permite determinar a frequência miccional, avaliar o volume miccional e os padrões miccionais e fazer medições ao longo de janelas de tempo de 6 h durante as fases escura e clara do dia. O método descrito neste relato pode ser aplicado a uma ampla variedade de estudos baseados em camundongos que exploram os aspectos fisiológicos e neurocomportamentais da micção voluntária em estados de saúde e doença.
Introduction
O armazenamento de urina e a micção são coordenados por um circuito central (sistema nervoso central) que recebe informações sobre o estado de enchimento vesical através dos nervos pélvico e hipogástrico. O urotélio, o epitélio que reveste o trato urinário da pelve renal até a uretra proximal, forma uma barreira apertada aos resíduos metabólicos e patógenos presentes na urina. É um componente integrante de uma teia sensorial, que detecta e comunica o estado de enchimento da bexiga aos tecidos subjacentes e nervos aferentes 1,2. A ruptura da barreira urotelial ou alterações nas vias de mecanotransdução urotelial podem levar à disfunção miccional associada a sintomas do trato urinário inferior, como frequência, urgência, noctúria e incontinência 3,4,5,6,7. Da mesma forma, sabe-se que o envelhecimento, o diabetes, as infecções do trato urinário inferior, a cistite intersticial e outros processos patológicos que afetam a bexiga urinária, ou o circuito associado que controla sua função, causam disfunção vesical 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18,19. Uma melhor compreensão do comportamento miccional normal e anormal depende do desenvolvimento de métodos que possam discriminar de forma confiável entre os diferentes padrões de micção.
Tradicionalmente, o comportamento miccional voluntário de camundongos tem sido estudado por meio do void spot assay (VSA), desenvolvido por Desjardins e colaboradores20, e amplamente adotado devido à sua simplicidade, baixo custo e abordagem não invasiva8,21,22,23,24. Esse ensaio é tipicamente realizado como um ensaio final, no qual um camundongo passa um tempo definido em uma gaiola forrada por um papel de filtro, que é posteriormente analisado contando o número e avaliando o tamanho das manchas de urina quando o papel de filtro é colocado sob luz ultravioleta (UV) (as manchas de urina fluorescem nessas condições)20. Apesar dessas muitas vantagens, a ASV tradicional apresenta algumas limitações importantes. Como os camundongos frequentemente urinam nas mesmas áreas, os investigadores têm que restringir a duração do ensaio a um período de tempo relativamente curto (≤4 h)25. Mesmo quando a VSA é realizada em períodos de tempo mais curtos, é quase impossível resolver pequenas manchas miccionais (SVSs) que caem sobre grandes manchas vazias ou, discriminar SVSs do transporte de urina aderida à cauda ou patas. Também é muito difícil distinguir se as SVS são consequência de eventos miccionais frequentes, mas individuais (fenótipo frequentemente observado em resposta à cistite4,26), ou devido ao gotejamento pós-miccional (fenótipo associado à obstrução vesical 27). Além disso, o desejo de completar o ensaio durante o horário de trabalho, juntamente com as dificuldades de acesso às instalações habitacionais quando as luzes são apagadas, muitas vezes limita esses ensaios ao período de luz do ciclo circadiano de 24 horas. Assim, essas restrições de tempo impedem a avaliação do comportamento miccional de camundongos durante sua fase noturna ativa, diminuindo a capacidade de analisar genes específicos ou tratamentos que são governados por ritmos circadianos.
Para superar algumas dessas limitações, pesquisadores desenvolveram métodos alternativos para avaliar o comportamento miccional em tempo real 26,28,29,30,31,32. Algumas dessas abordagens envolvem o uso de equipamentos de alto custo, como gaiolas metabólicas26,28,29, ou o uso de câmeras térmicas30; no entanto, estes também têm limitações. Por exemplo, em gaiolas metabólicas, a urina tende a aderir aos fios do chão de malha e às paredes do funil, reduzindo a quantidade de urina que é coletada e medida. Assim, pode ser difícil coletar dados com precisão sobre pequenos vazios. Além disso, as gaiolas metabólicas não fornecem informações sobre a distribuição espacial dos eventos miccionais (i.e., micção nos cantos vs. no centro da câmara). Dado que a radiação infravermelha de comprimento de onda longo utilizada pelas câmeras termográficas não penetra nos sólidos, a atividade miccional avaliada pela videotermografia deve ser realizada em um sistema aberto, o que pode ser desafiador com camundongos ativos, pois eles podem saltar vários centímetros no ar. Outro sistema é a abordagem automatizada de mancha anulada sobre papel (aVSOP)33, que consiste em papel de filtro enrolado que enrola a uma velocidade constante abaixo do piso de malha de arame de uma gaiola de mouse. Essa abordagem evita danos no papel e a sobreposição de manchas de urina que ocorrem no VSA clássico, e sua implementação permite que o investigador realize experimentos ao longo de vários dias. No entanto, não fornece ao investigador o momento preciso dos eventos miccionais, e não há capacidade de examinar o comportamento e como ele se correlaciona com a mancha. Para obter essas informações, pesquisadores incorporaram o videomonitoramento aos ensaios miccionais, uma abordagem que permite a avaliação simultânea da atividade do camundongo e dos eventos miccionais31,32. Uma abordagem consiste na colocação de um diodo emissor de luz azul (LED) e uma câmera de vídeo com um filtro de proteína de fluorescência verde sob a gaiola experimental para visualizar os eventos miccionais, e um LED infravermelho e uma câmera de vídeo acima da gaiola para capturar a posição do mouse32. Esta configuração tem sido usada para monitorar o comportamento miccional durante a realização de fotometria de fibra; No entanto, o ambiente iluminado desse sistema exigiu que os pesquisadores tratassem seus camundongos com um agente diurético para estimular a micção. Em outro desenho experimental, câmeras grande angulares foram colocadas acima e abaixo da gaiola experimental para visualizar eventos de atividade motora e micção de camundongos, respectivamente. Nesse caso, manchas de urina depositadas em um papel de filtro que reveste o chão da gaiola foram reveladas iluminando o papel filtro com luzes UV colocadas sob a gaiola31. Essa configuração foi utilizada em ensaios curtos, com 4 min de duração, durante a fase leve do dia, para estudar os neurônios do tronco encefálico envolvidos no comportamento miccional voluntário31. A adequação deste sistema para seu uso durante a fase escura ou por períodos de tempo >4 min não foi relatada.
Neste artigo, é descrito um método que aprimora o VSA tradicional, permitindo o monitoramento de vídeo de longo prazo do comportamento miccional do mouse. Essa abordagem custo-efetiva fornece informações temporais, espaciais e volumétricas sobre eventos miccionais por longos períodos de tempo durante as fases clara e escura do dia, juntamente com detalhes relacionados ao comportamento do camundongo 3,4,34. São fornecidas informações detalhadas para a construção das câmaras de micção, a implementação de um VSA em tempo real (RT-VSA) e a análise dos dados. O RT-VAR é valioso para pesquisadores que buscam compreender os mecanismos fisiológicos que controlam a função do sistema urinário, desenvolver abordagens farmacológicas para o controle da micção e definir as bases moleculares dos processos patológicos que afetam o trato urinário inferior.
Protocol
Representative Results
Discussion
A incorporação da videomonitoração é uma modificação custo-efetiva que apresenta diversas vantagens em relação à VSA clássica. No VSA clássico, que é tipicamente usado como um ensaio de ponto final, é difícil distinguir pontos vazios sobrepostos. Esta não é uma preocupação trivial, pois os ratos tendem a urinar várias vezes na mesma área quando o ensaio é prolongado por várias horas, normalmente nos cantos de sua gaiola. Assim, a primeira vantagem do RT-VSA é que o examinador pode facilmente ident…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por uma R01DK119183 de concessão do NIH (para G.A. e M.D.C.), um prêmio de projeto piloto através do P30DK079307 (para M.G.D.), um prêmio de Desenvolvimento de Carreira da Associação Americana de Urologia e uma concessão da Fundação Winters (para N.M.), e pelo Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores do Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307).
Materials
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 10 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 20 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 12 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 6 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 40 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 4 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 14.75 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 12 |
| 1.00” X 1.00” T-Slotted Profile – Four Open T-Slots – cut to 32 inches | 80/20 | 1010 | Amount: 5 |
| 1/4-20 Double Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3280 | Amount: 16 |
| 1/4-20 Triple Slide-in Economy T-Nut | 80/20 | 3287 | Amount: 18 |
| 10 & 25 Series 2 Hole – 18mm Slotted Inside Corner Bracket with Dual Support | 80/20 | 14061 | Amount: 6 |
| 10 Series 3 Hole – Straight Flat Plate | 80/20 | 4118 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole – "L" Flat Plate | 80/20 | 4081 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole – "T" Flat Plate | 80/20 | 4080 | Amount: 8 |
| 10 Series 5 Hole – Tee Flat Plate | 80/20 | 4140 | Amount: 2 |
| 10 Series Standard Lift-Off Hinge – Right Hand Assembly | 80/20 | 2064 | Amount: 2 |
| 10 to 15 Series 2 Hole – Lite Transition Inside Corner Bracket | 80/20 | 4509 | Amount: 6 |
| 24”-long UV tube lights | ADJ Products LLC | T8-F20BLB24 | Amount: 2 20W bulb – 24” Wavelength: 365nm |
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 1 82.5 cm x 26.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 26.5 cm X 30.5 cm |
|
| Acrylic Mirror Sheet | Profesional Plastics | Amount: 2 82.5 cm x 30.5 cm |
|
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 2 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 26.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 38.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear, 26.5 cm x 21.5 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear 37.5 cm x 23.9 cm |
| AR polycarbonate (UV resistance) | 80/20 | 65-2641 | Amount: 4 4.5mm Thick, Clear , 24.4 cm x 23.9 cm |
| Chromatography paper (thin paper) | Thermo Fisher Scientific | 57144 | |
| Cosmos blotting paper (thick paper) | Blick Art Materials | 10422-1005 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | Version 9.4.0 | graphing and statistics software |
| ImageJ FIJI | NIH | ||
| Parafilm | Merck | transparent film | |
| Quick Time Player 10.5 software | Apple | multimedia player | |
| Security spy | Ben software | video surveillance software system | |
| Standard End Fastener, 1/4-20 | 80/20 | 3381 | Amount: 80 |
| UV transmitting acrylic | Spartech | Polycast Solacryl SUVT | Amount: 2 38.5 cm x 26.5 cm |
| Water gel: HydroGel | ClearH2O | 70-01-5022 | (https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/) |
| Webcam | Logitech | C930e | Amount: 4 |
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