सामान्य और ट्यूमर स्तन ऊतक से माउस और मानव उपकला ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करना और इमेजिंग करना
Summary
यह प्रोटोकॉल अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से प्राथमिक सामान्य और ट्यूमर स्तन ऊतक से उपकला ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक दृष्टिकोण पर चर्चा करता है। इसके अलावा, तीन आयामी संवर्धन के साथ-साथ एम्बेडेड ऑर्गेनोइड्स के इम्यूनोफ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए निर्देश शामिल हैं।
Abstract
ऑर्गेनोइड्स अपने आत्म-आयोजन गुणों और प्राथमिक ऊतक या स्टेम कोशिकाओं से प्रसार के बाद कार्य और वास्तुकला के प्रतिधारण के कारण अंग ऊतक मॉडलिंग के लिए एक विश्वसनीय विधि है। ऑर्गेनॉइड पीढ़ी की यह विधि कई मार्गों के माध्यम से एकल-कोशिका भेदभाव को दूर करती है और इसके बजाय यांत्रिक और एंजाइमेटिक रूप से अलग ऊतकों से स्तन उपकला ऑर्गेनोइड्स को अलग करने के लिए अंतर सेंट्रीफ्यूजेशन का उपयोग करती है। यह प्रोटोकॉल कोलेजन और बेसमेंट बाह्य मैट्रिक्स में ऑर्गेनॉइड एम्बेडिंग के लिए तकनीकों के अलावा माउस और मानव स्तन ऊतक दोनों से छोटे और बड़े उपकला ऑर्गेनोइड्स के तेजी से उत्पादन के लिए एक सुव्यवस्थित तकनीक प्रदान करता है। इसके अलावा, ऑर्गेनॉइड आकृति विज्ञान और घनत्व की कल्पना करने के उद्देश्य से इन-जेल निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरोसेंट स्टेनिंग के निर्देश प्रदान किए जाते हैं। ये पद्धतियां असंख्य डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों के लिए उपयुक्त हैं, जैसे कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ सह-संवर्धन और कोलेजन आक्रमण परख के माध्यम से विवो मेटास्टेसिस मॉडलिंग। ये विश्लेषण सेल-सेल व्यवहार को बेहतर ढंग से स्पष्ट करने और ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट के भीतर बातचीत की अधिक पूर्ण समझ बनाने के लिए काम करते हैं।
Introduction
विट्रो में उपकला कोशिकाओं को मॉडल करने की क्षमता आधुनिक जैव चिकित्सा अनुसंधान की नींव रही है क्योंकि यह सेलुलर विशेषताओं को पकड़ती है जो विवो में सुलभ नहीं हैं। उदाहरण के लिए, दो-आयामी विमान में बढ़ती उपकला कोशिका रेखाएं प्रसार1 के दौरान उपकला कोशिका में होने वाले आणविक परिवर्तनों का आकलन प्रदान कर सकती हैं। इसके अलावा, सिग्नलिंग और जीन अभिव्यक्ति के बीच गतिशील विनियमन को मापना विवो सिस्टम2 में सीमित है। कैंसर अनुसंधान में, कैंसर उपकला सेल लाइन मॉडलिंग ने रोग की प्रगति और संभावित दवा लक्ष्यों के आणविक ड्राइवरों की पहचान को सक्षमकिया है। हालांकि, दो-आयामी विमान पर बढ़ते कैंसर उपकला कोशिका लाइनों की सीमाएं हैं, क्योंकि अधिकांश आनुवंशिक रूप से अमर और संशोधित होते हैं, अक्सर प्रकृति में क्लोनल होते हैं, गैर-शारीरिक स्थितियों में बढ़ने की उनकी क्षमता के लिए चुने जाते हैं, तीन-आयामी (3 डी) ट्यूमर ऊतक वास्तुकला के उनके मूल्यांकन में सीमित होते हैं, और यथार्थवादी ऊतक वातावरणके भीतर माइक्रोएन्वायरमेंट इंटरैक्शन को पर्याप्त रूप से मॉडल नहीं करते हैं। ये बाधाएं विशेष रूप से मॉडलिंग मेटास्टेसिस में स्पष्ट हैं, जिसमें विवो में कई अलग-अलग जैविक चरण शामिल हैं, जिनमें दूर के अंग स्थल5 पर आक्रमण, प्रसार, परिसंचरण और उपनिवेशीकरण शामिल हैं।
कैंसर उपकला ऑर्गेनोइड्स को ट्यूमर 6,7,8 के 3 डी वातावरण और व्यवहार को बेहतर ढंग से पुन: व्यवस्थित करने के लिए विकसित किया गया है। ऑर्गेनोइड्स को पहली बार एकल एलआरजी 5 + आंतों के क्रिप्ट कोशिकाओं से विकसित किया गया था और क्रिप्ट-विलस इकाइयों की 3 डी संरचना का प्रतिनिधित्व करने के लिए विभेदित किया गया था जो विट्रो 9 में छोटी आंत की पदानुक्रमित संरचना को बनाए रखते थे। इस दृष्टिकोण ने होमोस्टेटिक और तनाव स्थितियों के तहत आत्म-व्यवस्थित ऊतक वास्तुकला के वास्तविक समय के विज़ुअलाइज़ेशन और लक्षण वर्णन की अनुमति दी। एक प्राकृतिक विस्तार के रूप में, कैंसर उपकला ऑर्गेनोइड्स को कोलोरेक्टल 10, अग्नाशय11, स्तन 12, यकृत13, फेफड़े14, मस्तिष्क15 और गैस्ट्रिक कैंसर16 सहित कई अलग-अलग कैंसर प्रकारों को मॉडल करने के लिए विकसितकिया गया था। कैंसर एपिथेलियल ऑर्गेनोइड्स का उपयोग कैंसर के विकास17,18 और मेटास्टैटिक स्पैटियोटेम्पोरल व्यवहार19,20 को चिह्नित करने और ट्यूमर विषमता 21 से पूछताछ करने और केमोथेरेपी22 का परीक्षण करनेके लिए किया गया है। कैंसर एपिथेलियल ऑर्गेनोइड्स को भी अलग किया गया है और चल रहे नैदानिक परीक्षणों के दौरान एंटीकैंसर एजेंटों और विकिरण चिकित्सा के लिए रोगी की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करने के लिए एकत्र किया गया है। इसके अलावा, कैंसर उपकला ऑर्गेनोइड्स को शामिल करने वाली प्रणालियों को अन्य गैर-कैंसर कोशिकाओं, जैसे प्रतिरक्षा कोशिकाओं के साथ जोड़ा जा सकता है, ताकि वास्तविक समय में बातचीत की कल्पना करने के लिए ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट का अधिक व्यापक मॉडल बनाया जा सके, यह उजागर किया जा सके कि कैंसर उपकला कोशिकाएं प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं जैसे साइटोटोक्सिक प्रभावक प्रतिरक्षा कोशिकाओं की मौलिक प्रकृति को कैसे बदलती हैं, और संभावित इम्यूनोथेरेपी और एंटीबॉडी-ड्रग निर्भर साइटोटोक्सिक गतिविधिका परीक्षण करती हैं। 27,28. यह लेख कोलेजन और बेसमेंट एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स (ईसीएम) में पासिंग और एम्बेडिंग के बिना उपकला ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने की एक विधि को प्रदर्शित करता है। इसके अतिरिक्त, पृथक ऑर्गेनोइड्स की डाउनस्ट्रीम इमेजिंग के लिए तकनीकें भी साझा की जाती हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
ट्यूमर ऑर्गेनोइड्स उत्पन्न करने के लिए साहित्य में विभिन्न तरीकों का वर्णन किया गया है। यह प्रोटोकॉल पासिंग के बिना ट्यूमर से सीधे ट्यूमर ऑर्गेनोइड उत्पन्न करने के लिए एक विधि पर प्रकाश डालता है। इस ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को मेटविवोर, पीटर कार्लसन ट्रस्ट, थेरेसा रिसर्च फाउंडेशन और एनसीआई / यूटीएसडब्ल्यू सिमंस कैंसर सेंटर पी 30 सीए 142543 द्वारा प्रदान किए गए धन द्वारा समर्थित किया गया था। हम टेक्सास विश्वविद्यालय के दक्षिण-पश्चिमी ऊतक प्रबंधन साझा संसाधन की सहायता को स्वीकार करते हैं, सिमंस कॉम्प्रिहेंसिव कैंसर सेंटर में एक साझा संसाधन, जिसे पुरस्कार संख्या पी 30 सीए 142543 के तहत राष्ट्रीय कैंसर संस्थान द्वारा आंशिक रूप से समर्थित किया गया है। चान लैब के सभी सदस्यों के लिए विशेष धन्यवाद।
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
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