Generazione e imaging di organoidi epiteliali di topo e umani da tessuto mammario normale e tumorale senza passaggio
Summary
Questo protocollo discute un approccio per generare organoidi epiteliali dal tessuto mammario primario normale e tumorale attraverso la centrifugazione differenziale. Inoltre, sono incluse istruzioni per la coltura tridimensionale e l’imaging immunofluorescente di organoidi incorporati.
Abstract
Gli organoidi sono un metodo affidabile per modellare il tessuto degli organi grazie alle loro proprietà auto-organizzanti e alla conservazione della funzione e dell’architettura dopo la propagazione dal tessuto primario o dalle cellule staminali. Questo metodo di generazione di organoidi rinuncia alla differenziazione di singole cellule attraverso passaggi multipli e utilizza invece la centrifugazione differenziale per isolare organoidi epiteliali mammari da tessuti dissociati meccanicamente ed enzimaticamente. Questo protocollo fornisce una tecnica semplificata per produrre rapidamente organoidi epiteliali piccoli e grandi sia dal tessuto mammario di topo che da quello umano, oltre alle tecniche per l’incorporazione di organoidi nel collagene e nella matrice extracellulare basale. Inoltre, vengono fornite istruzioni per la fissazione in gel e la colorazione immunofluorescente allo scopo di visualizzare la morfologia e la densità degli organoidi. Queste metodologie sono adatte per una miriade di analisi a valle, come la co-coltura con cellule immunitarie e la modellazione di metastasi ex vivo tramite il saggio di invasione del collagene. Queste analisi servono a chiarire meglio il comportamento cellula-cellula e creare una comprensione più completa delle interazioni all’interno del microambiente tumorale.
Introduction
La capacità di modellare le cellule epiteliali in vitro è stata il fondamento della moderna ricerca biomedica perché cattura caratteristiche cellulari che non sono accessibili in vivo. Ad esempio, la crescita di linee cellulari epiteliali in un piano bidimensionale può fornire una valutazione dei cambiamenti molecolari che si verificano in una cellula epiteliale durante la proliferazione1. Inoltre, la misurazione della regolazione dinamica tra segnalazione ed espressione genica è limitata nei sistemi in vivo 2. Nella ricerca sul cancro, la modellazione della linea cellulare epiteliale del cancro ha permesso l’identificazione dei driver molecolari della progressione della malattia e dei potenziali bersagli farmacologici3. Tuttavia, la crescita di linee cellulari epiteliali tumorali su un piano bidimensionale ha dei limiti, poiché la maggior parte sono geneticamente immortalate e modificate, spesso di natura clonale, selezionate per la loro capacità di crescere in condizioni non fisiologiche, limitate nella loro valutazione dell’architettura tridimensionale (3D) del tessuto tumorale e non modellano adeguatamente le interazioni del microambiente all’interno di un ambiente tissutale realistico4. Questi vincoli sono particolarmente evidenti nella modellazione delle metastasi, che in vivo include diverse fasi biologiche distinte, tra cui invasione, disseminazione, circolazione e colonizzazione nel sito dell’organo distante5.
Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sviluppati per ricapitolare meglio l’ambiente 3D e il comportamento dei tumori 6,7,8. Gli organoidi sono stati inizialmente sviluppati da singole cellule della cripta intestinale LRG5+ e differenziati per rappresentare la struttura 3D delle unità crypt-villus che hanno mantenuto la struttura gerarchica dell’intestino tenue in vitro9. Questo approccio ha permesso la visualizzazione in tempo reale e la caratterizzazione dell’architettura tissutale auto-organizzante in condizioni omeostatiche e di stress. Come estensione naturale, gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sviluppati per modellare molti diversi tipi di cancro, tra cui colorettale 10, pancreatico 11, seno12, fegato 13, polmone 14, cervello 15 e tumori gastrici 16. Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati sfruttati per caratterizzare l’evoluzione del cancro17,18 e i comportamenti spazio-temporali metastatici 19,20 e interrogare l’eterogeneità tumorale 21 e testare le chemioterapie 22. Gli organoidi epiteliali del cancro sono stati anche isolati e raccolti durante gli studi clinici in corso per prevedere la risposta del paziente agli agenti antitumorali e alla radioterapia ex vivo 8,23,24,25. Inoltre, i sistemi che incorporano organoidi epiteliali tumorali possono essere combinati con altre cellule non tumorali, come le cellule immunitarie, per formare un modello più completo del microambiente tumorale per visualizzare le interazioni in tempo reale, scoprire come le cellule epiteliali tumorali cambiano la natura fondamentale delle cellule immunitarie effettrici citotossiche come le cellule natural killer e testare potenziali immunoterapie e attività citotossica anticorpo-farmaco dipendente26, 27,28. Questo articolo dimostra un metodo per generare organoidi epiteliali senza passare e incorporare nel collagene e nella matrice extracellulare basale (ECM). Inoltre, vengono condivise anche tecniche per l’imaging a valle di organoidi isolati.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi metodi sono stati descritti in letteratura per generare organoidi tumorali. Questo protocollo evidenzia un metodo per generare organoidi tumorali direttamente dal tumore senza passare. Utilizzando questo metodo, gli organoidi tumorali sono producibili entro poche ore dall’inizio della procedura e generano quasi il 100% di organoidi vitali rispetto al 70% riportato in letteratura31. In confronto, altri metodi richiedono il passaggio seriale delle cellule in organoidi per diverse settimane. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato da finanziamenti forniti da METAvivor, Peter Carlson Trust, Theresa’s Research Foundation e NCI / UTSW Simmons Cancer Center P30 CA142543. Riconosciamo l’assistenza della University of Texas Southwestern Tissue Management Shared Resource, una risorsa condivisa presso il Simmons Comprehensive Cancer Center, che è supportata in parte dal National Cancer Institute con il numero di premio P30 CA142543. Un ringraziamento speciale a tutti i membri del Chan Lab.
Materials
| 10 mM HEPES Buffer | Gibco | 15630080 | |
| 100x Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240-096 | |
| 100x Glutamax | Life Technologies | 35050-061 | Glutamine supplement |
| 100x Insulin-Transferrin-Selenium (ITS) | Life Technologies | 51500-056 | |
| 100x Penicillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Sigma | P4333 | |
| 10x DMEM | Sigma | D2429 | |
| 50 mL/0.2 µm filter flask | Fisher | #564-0020 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290-018 | |
| bFGF | Sigma | F0291 | |
| BSA Solution (32%) | Sigma | #A9576 | |
| Cholera Toxin | Sigma | C8052 | |
| CO2-Independent Medium | Gibco | 18045-088 | |
| Collagenase A | Sigma | C2139 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase) | Sigma | D4263 | |
| DMEM with 4500 mg/L glucose, sodium pyruvate, and sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D6546 | Common basal medium |
| D-MEM/F12 | Life Technologies | #10565-018 | Basal cell medium |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma | #D8662 | PBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | #F0926 | |
| Gentamicin | Life Technologies | #15750-060 | |
| Human epidermal growth factor (EGF) | Sigma | E9644 | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0396 | |
| Insulin | Sigma | #I9278 | |
| Matrigel | Corning | #354230 | Basement Extracellular Matrix (BECM) |
| NaOH (1 N) | Sigma | S2770 | |
| Rat Tail Collagen I | Corning | 354236 | |
| RPMI-1640 media | Fisher | SH3002701 | |
| Trypsin | Life Technologies | 27250-018 |
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