使用改良的夹心 ELISA 定量来自中性粒细胞胞外陷阱的髓过氧化物酶 DNA 和中性粒细胞弹性蛋白酶 DNA 复合物

Summary

我们提出了一种改进的夹心酶联免疫吸附测定技术方案，以定量测量中性粒细胞细胞外捕获残留物的两种成分，髓过氧化物酶偶联-DNA 和中性粒细胞弹性蛋白酶偶联 DNA 复合物，来源于活化的中性粒细胞。

Abstract

某些刺激，如微生物，导致中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱（NET），其基本上是由DNA与颗粒蛋白组成的网状结构，如髓过氧化物酶（MPO）和中性粒细胞弹性蛋白（NE），以及细胞质和细胞骨架蛋白。尽管最近对NETs的兴趣有所增加，但没有灵敏，可靠的测定方法可用于在临床环境中测量NET。本文描述了一种改良的夹心酶联免疫吸附测定法，用于定量测量循环 NET 的两种成分，MPO-DNA 和 NE-DNA 复合物，它们是 NET 的特定成分，并作为 NET 的分解产物释放到细胞外空间。该测定使用用于MPO或NE的特异性单克隆抗体作为捕获抗体和DNA特异性检测抗体。MPO 或 NE 在含有 MPO-DNA 或 NE-DNA 复合物的样品初始孵育期间与捕获抗体的一个位点结合。该测定显示出良好的线性和高测定间和测定内精度。我们在16名伴有急性呼吸窘迫综合征的COVID-19患者中使用了它，发现MPO-DNA和NE-DNA的血浆浓度明显高于从健康对照获得的血浆。该检测法是研究人血浆和培养上清液中NET特征的可靠、高灵敏度和有用的方法。

Introduction

本文概述了一种定量生物体液中中性粒细胞细胞外捕获 （NET） 形成的方法，方法是使用夹心酶联免疫吸附测定法 （ELISA） 检测髓过氧化物酶 （MPO） 和中性粒细胞弹性蛋白酶 （NE） 与 DNA ^1,2 的复合物。NET由装饰有源自中性粒细胞颗粒^3,4的抗菌蛋白酶的DNA骨架组成。MPO-DNA和NE-DNA复合物都是NET的重要和特异性成分，并作为^NETs的分解产物释放到细胞外空间^3,4。

NETs除了在^{抗菌防御中}起重要的生理作用3外，还具有多种病理作用^4,5，包括促进血栓形成⁶ 和脓毒症恶化⁷。因此，NET最近引起了人们的关注。然而，由于缺乏灵敏、可靠的定量测定方法，NET的 体内 定量已被证明具有挑战性。

有几种方法可用，包括通过荧光显微镜^8,9和流式细胞术¹⁰直接测量NET，以及间接测量循环游离DNA，核小体和瓜氨酸组蛋白H3，但每种方法都有自己的优点和局限性¹¹。尽管免疫荧光显微镜方法特定于NETs，并且清楚地显示了NET的定位和形成程度，但样本仅限于活检组织和分泌物质。此外，该方法需要由熟练的研究人员进行，并且需要很长时间才能获得结果。通过流式细胞术测量NET相关成分的循环水平很容易，并且可以快速提供结果;但是，该方法并非特定于^{NETs 12}。

我们¹³ 和其他人 ^1,2 开发了一种高度灵敏且可靠的检测方法，用于使用改进的 ELISA 技术测量人血浆中循环的 NET 组分、MPO 偶联或 NE 偶联 DNA，该技术使用 MPO 或 NE 的特异性抗体作为捕获抗体和 DNA 特异性检测抗体。该测定法还可用于离体鉴定活化的中性粒细胞响应佛波醇 12-肉豆蔻酸 13-乙酸酯 （PMA） 刺激释放的细胞培养上清液中的 NET 组分。

Protocol

这项研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的，并得到了爱知医科大学机构审查委员会的批准（2017-H341,2019-H137）。从每个参与者那里获得了书面知情同意。 1. 试剂制备 注意：为了进行夹心ELISA测定，试剂的制备如下所述。 包衣缓冲液：要制备0.1 mol/L碳酸氢盐缓冲液，称取10.6 g无水碳酸钠（分子量，106 g/mol）和8.4 g碳酸氢钠（分子量?…

Representative Results

该方法使用具有抗MPO、抗NE和抗DNA单克隆抗体的夹心ELISA来测量MPO相关和NE相关DNA（图1）。在该方法中，微量滴定板的孔涂有MPO特异性或NE特异性单克隆抗体，以捕获DNA相关的MPO和DNA相关的NE，以及非DNA相关的MPO和NE。为了计算测定内变异系数（CV），在同一板内对从COVID-19和健康对照患者收集的30个样本进行重复测量，并将%CV计算为重复测量的平均值;为了计算测定间CV（即板对…

Discussion

我们已经描述了一种夹心ELISA方法，其中MPO或NE在含有MPO-DNA或NE-DNA复合物的样品的初始孵育期间与捕获抗体的一个位点结合。洗涤后，通过将样品与过氧化物酶相关的抗DNA单克隆抗体孵育来完成“三明治”。去除未结合的二抗后，通过添加显色ABTS过氧化物酶底物来检测结合的过氧化物酶偶联物，其产生可溶性终产物，可以在405nm处通过分光光度法读取。良好的线性、较高的测定间和测定内精密度?…

Materials

1-Step Polymorphs	Accurate Chemical and Scientific Corporation	AN221725	Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate	Thermo Fisher Scientific	467466	flat bottom
ABTS buffer solution	Sigma-Aldrich Merck	11 204 530 001	Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate.
ABTS tablets	Sigma-Aldrich Merck	11 204 521 001	Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen	Thermo Fisher Scientific	14222348
Anti-MPO antibody	Sigma-Aldrich Merck	07-496-I	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10	Sigma-Aldrich Merck	MABS461	Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin	Biomedical Science	BR-220700081	Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I	New England BioLabs	M0303M	Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control	GENETEX, Inc.	GTX35035	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4	Merck	MABC002	Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube	Becton Dickinson and Company
Microplate mixer	As one corporation	NS-P
Microplate Reader	Molecular Devices	SpectraMax 190	Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application	Molecular Devices	SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA	Roche Diagnostics	1154467500	bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate	Sigma-Aldrich Merck	P8139	Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution	Takara Bio	T9181	Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5	Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide	Fujifilm Wako Chemicals	190-14901	Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Fujifilm Wako Chemicals	9002-93-1	Store at room temperature.