Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/64644
Automatic Translation
1, 2, 2, 2, 2
1Department of Biochemistry and Biotechnology, University of Science and Technology Chittagong (USTC), 2Department of Emergency and Critical Care Medicine, Aichi Medical University

Summary

We presenteren een protocol voor een gemodificeerde sandwich enzym-gebonden immunosorbent assay techniek om kwantitatief twee componenten van neutrofiele extracellulaire val restanten, myeloperoxidase geconjugeerd-DNA en neutrofiele elastase geconjugeerd-DNA complexen, afgeleid van geactiveerde neutrofielen.

Abstract

Bepaalde stimuli, zoals micro-organismen, zorgen ervoor dat neutrofielen neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) vrijgeven, die in feite webachtige structuren zijn die zijn samengesteld uit DNA met korreleiwitten, zoals myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastase (NE), en cytoplasmatische en cytoskeletale eiwitten. Hoewel de belangstelling voor NET's de laatste tijd is toegenomen, is er geen gevoelige, betrouwbare testmethode beschikbaar voor het meten van NET's in klinische omgevingen. Dit artikel beschrijft een gemodificeerde sandwichenzym-gebonden immunosorbenttest om twee componenten van circulerende NET's, MPO-DNA en NE-DNA-complexen, kwantitatief te meten, die specifieke componenten van NET's zijn en in de extracellulaire ruimte worden vrijgegeven als afbraakproducten van NET's. De test gebruikt specifieke monoklonale antilichamen voor MPO of NE als de vangstantistoffen en een DNA-specifiek detectieantilichaam. MPO of NE bindt aan één plaats van het vangantilichaam tijdens de eerste incubatie van monsters die MPO-DNA of NE-DNA-complexen bevatten. Deze assay toont een goede lineariteit en een hoge inter-assay en intra-assay precisie. We gebruikten het bij 16 patiënten met COVID-19 met bijbehorend acuut respiratoir distress-syndroom en vonden dat de plasmaconcentraties van MPO-DNA en NE-DNA significant hoger waren dan in het plasma verkregen uit gezonde controles. Deze detectietest is een betrouwbare, zeer gevoelige en nuttige methode voor het onderzoeken van de kenmerken van NET's in menselijk plasma en kweeksupernatanten.

Introduction

Dit artikel schetst een methode om de vorming van neutrofiele extracellulaire val (NET) in biologische vloeistoffen te kwantificeren met behulp van sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) om complexen van myeloperoxidase (MPO) en neutrofiele elastase (NE) te detecteren met DNA 1,2. NET's bestaan uit een DNA-ruggengraat versierd met antimicrobiële proteasen afkomstig van neutrofiele korrels 3,4. Zowel MPO-DNA- als NE-DNA-complexen zijn belangrijke en specifieke componenten van NET's en worden vrijgegeven in de extracellulaire ruimte als afbraakproducten van NETs 3,4.

Naast hun belangrijke fysiologische rol in antimicrobiële afweer3, hebben NET's ook verschillende pathologische effecten4,5, waaronder de bevordering van trombogenese6 en de verergering van sepsis7. Dienovereenkomstig hebben NET's de laatste tijd aandacht gekregen. Niettemin is de in vivo kwantificering van NET's een uitdaging gebleken vanwege het ontbreken van een gevoelige, betrouwbare kwantitatieve testmethode.

Er zijn enkele methoden beschikbaar, waaronder de directe meting van NET's door fluorescentiemicroscopie8,9 en flowcytometrie 10 en de indirecte meting van circulerend celvrij DNA, nucleosomen en citrullinated histon H3, maar elke methode heeft zijn eigen voordelen en beperkingen11. Hoewel de immunofluorescentiemicroscopische methode specifiek is voor NET's en duidelijk de lokalisatie en mate van NET-vorming laat zien, zijn monsters beperkt tot biopsieweefsel en uitgescheiden materialen. Bovendien moet deze methode worden uitgevoerd door bekwame onderzoekers en duurt het lang voordat resultaten worden verkregen. Het meten van circulerende niveaus van NET-gerelateerde componenten door middel van flowcytometrie is eenvoudig en levert snel resultaten op; De methode is echter niet specifiek voor NET's12.

Wij13 en anderen1,2 hebben een zeer gevoelige en betrouwbare test ontwikkeld om de circulerende NET-componenten, MPO-geconjugeerd of NE-geconjugeerd DNA, in menselijk plasma te meten met een gemodificeerde ELISA-techniek die specifieke antilichamen voor MPO of NE gebruikt als de vangstantistoffen en een DNA-specifiek detectieantilichaam. Deze test kan ook ex vivo worden gebruikt om NET-componenten te identificeren in celkweeksupernatanten die vrijkomen door geactiveerde neutrofielen als reactie op phorbol 12-myristate 13-acetaat (PMA) stimulatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Deze studie werd uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki en werd goedgekeurd door de institutionele beoordelingsraden van de Aichi Medical University (2017-H341, 2019-H137). Van elke deelnemer werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen.

1. Reagensbereiding

OPMERKING: Om de sandwich ELISA-test uit te voeren, worden de reagentia bereid zoals hieronder beschreven.

  1. Coating buffer:
    1. Om een 0,1 mol/l carbonaat-bicarbonaatbuffer te maken, weegt u 10,6 g watervrij natriumcarbonaat (molecuulgewicht, 106 g/mol) en 8,4 g natriumbicarbonaat (molecuulgewicht, 84 g/mol).
    2. Voeg het toe aan ongeveer 900 ml gedestilleerd water in een bekerglas.
    3. Stel de pH van de buffer in op 9,6 door de vereiste hoeveelheid verdund zoutzuur of natriumhydroxide toe te voegen.
    4. Controleer de pH met een pH-meter.
    5. Voeg vervolgens het vereiste volume gedestilleerd water toe om een totaal volume van 1.000 ml te bereiken.
    6. Bewaar deze 0,1 mol/L carbonaat-bicarbonaatbuffer in de koelkast bij 4 °C.
  2. Blokkerende buffer:
    1. Voeg ongeveer 250 μL 20% natriumazide en 1 g runderserumalbumine (BSA) toe aan 70 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bestaande uit 137 mmol/L NaCl, 8,1 mmol/L Na 2 HPO 4, 2,68 mmol/L KCl en 1,47 mol/L KH2PO 4(pH7,4) en meng voorzichtig.
    2. Voeg gedestilleerd water toe om een totaal volume van 100 ml te bereiken. De uiteindelijke concentraties van runderserumalbumine en natriumazide zijn respectievelijk 1% en 0,05%. Wacht 10 minuten en dan is de oplossing klaar voor gebruik.
  3. Wasoplossing: Bereid 0,5% t-octylfenoxypolyethoxyethanol, polyethyleenglycol tert-octylfenylether (Triton X-100) in gedestilleerd water.
    1. Verdun 100% Triton X-100 tot 10% met gedestilleerd water en laat de 10% oplossing 1 dag voor gebruik staan.
    2. Verdun vervolgens de 10% Triton X-100-oplossing 20-voudig met gedestilleerd water om een concentratie van 0,5% te bereiken.
  4. Verdunning van antilichamen:
    1. Verdun het afvangantilichaam (anti-MPO-antilichaam [1 mg/ml] of anti-NE-antilichaam [1 mg/ml]) tot 1:2.000 in de coatingbuffer (pH 9,6) vóór gebruik op dag 1 van de test (zie hieronder) en het detectieantilichaam (peroxidase-geconjugeerd anti-DNA-antilichaam) tot 1:40 met PBS vóór gebruik op dag 3 van de test (zie hieronder).
      OPMERKING: Verdun voor het voorlopige experiment de iso-type antilichamen (IgG-konijn [5 mg / ml] en IgG1-muiskloon Ci4 [0,5 mg / ml]) tot 1: 10.000 en 1: 1.000 in de coatingbuffer (pH 9,6).
  5. ABTS-substraatoplossing: Los afhankelijk van het aantal monsters één, twee of drie 2,2'-azino-bis (3 ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur (ABTS) tabletten op in 5 ml, 10 ml of 15 ml ABTS-buffer (met natriumperboraat, citroenzuur en dinatriumwaterstoffosfaat); 100 μL is nodig per monster. Bewaar de bereide oplossing bij 2-8 °C beschermd tegen licht. De oplossing is stabiel voor maximaal 3 maanden.

2. Monsterverzameling en -opslag

  1. Plasma-isolatie:
    1. Verzamel 4 ml perifere bloedmonsters in een lithium heparine bloedafnamebuis door venapunctie met een spuit van 22 G en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 4 °C op 1.600 x g .
    2. Breng het supernatant over in een 2 ml safe-lock monsterbuis.
    3. Centrifugeer het supernatant opnieuw bij 16.000 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C om eventuele resterende cellen te verwijderen.
    4. Verzamel het supernatant in een nieuwe safe-lock monsterbuis zonder de pellet aan de onderkant van de buis te verstoren.
    5. Bewaar het verkregen plasma bij −80 °C tot verder gebruik.
      OPMERKING: Om met deze test resultaten met een hoge doorvoer te verkrijgen, zijn monsters van goede kwaliteit vereist. Als plasmamonsters worden gebruikt, voert u een tweede centrifugatie uit om eventuele resterende cellen te verwijderen. Vermijd herhaaldelijk ontdooien van de monsters. Gebruik heparine als antistollingsmiddel omdat EDTA de DNase-activiteit beïnvloedt.
  2. Isolatie van polymorfonucleaire neutrofielen
    1. Verzamel de perifere bloedmonsters in een lithium heparine bloedafnamebuis door venapunctie met een spuit van 22 G.
    2. Leg 6 ml bloed op 6 ml eenstaps polymorfen en centrifugeer de buizen gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur (RT) op 1.000 x g .
    3. Oogst de derde buffy vachtlaag met neutrofielen en was deze drie keer in fenolroodvrije RPMI-1640 op 400 x g gedurende 10 minuten bij RT.
    4. Resuspendeer de neutrofielen in fenolroodvrij RPMI-1640 met 2 mM L-glutamine aangevuld met 6% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum en tel de cellen in het microscoopveld met een hemocytometer.
      OPMERKING: Deze methode levert 96% tot 98% zuiverheid met meer dan 95% levensvatbaarheid, zoals beoordeeld door trypan blauwe kleurstofuitsluiting.
  3. Activering van polymorfonucleaire neutrofielen en NETosis in vitro
    1. Verdun vers geïsoleerde polymorfonucleaire neutrofielen tot 1 × 105 cellen/ml in fenolroodvrij RPMI-1640 met 2 mM L-glutamine aangevuld met 6% warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum, en zaai ze in kweekschalen van 35 mm.
    2. Om NET's te induceren, stimuleer polymorfonucleaire neutrofielen met 25 nM PMA gedurende 4 uur bij 37 °C in 5% CO2/95% lucht.
    3. Na 4 uur incubatie verteert u de NET's gedeeltelijk door 0,6 μg/ml DNase I rechtstreeks aan de kweekschalen toe te voegen gedurende 15 minuten bij RT, en stopt u de DNase I-activiteit door 5 mM EDTA toe te voegen.
    4. Verzamel het medium dat de gesynthetiseerde NET's bevat en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g bij 4 °C om het celafval te verwijderen.
    5. Verkrijg de supernatanten uit vier gezonde controles, meng en bewaar bij −80 °C tot gebruik.
      OPMERKING: DNase-verteerde PMA-gestimuleerde neutrofielen verkregen uit vier gezonde controles worden gebruikt als de NET-standaard 1,14,15. Genereer een kalibratiecurve van een serieel verdunde NET-standaard met PBS en wijs de optische dichtheid (OD) waarden verkregen uit een onverdunde NET-standaard toe als 100% NET.

3. Testmethode

OPMERKING: De stappen voor het uitvoeren van de test worden hieronder in detail beschreven.

  1. Dag 1
    1. Breng in totaal 100 μl verdund anti-MPO- of anti-NE-antilichaam met 0,05 μg antilichaam aan op elk putje van de plaat, inclusief het blanco putje.
      OPMERKING: De coatingbuffer mag geen reinigingsmiddel bevatten, omdat de antilichamen anders mogelijk niet gelijkmatig en soepel aan de wanden van elke put binden. Om het haakeffect te voorkomen, mag de concentratie van het coatingeiwit niet hoger zijn dan 20 μg/ml, omdat concentraties boven dat niveau de meeste beschikbare plaatsen op de microtiterplaat zullen verzadigen. Het typische concentratiebereik van eiwitcoatingoplossingen is 2-10 μg / ml. Gebruik voor het voorlopige experiment verdund iso-type controle-antilichaam IgG-konijn voor coating in plaats van specifieke monoklonale antilichamen tegen MPO. Gebruik verdund iso-type controleantilichaam IgG1-muis voor coating in plaats van specifieke monoklonale antilichamen tegen NE.
    2. Bedek de plaat met een zelfklevende plastic afdekking om de verdamping van het monster te voorkomen en incuber een nacht bij 4 °C om de afvangantistoffen te kunnen binden.
  2. Dag 2
    1. Gooi de verdunde antilichaamoplossing uit de putjes weg en pipetteer vervolgens 300 μL wasoplossing per put en herhaal deze wasprocedure drie tot vier keer.
    2. Verwijder overtollige PBS door de plaat droog te tikken op een papieren handdoek.
    3. Blokkeer elk putje van de ELISA-plaat met 200 μL van de blokkeringsbuffer.
    4. Bedek de plaat goed met een zelfklevende plastic afdekking en incuber deze gedurende 1,5-2 uur bij RT om de putten te belemmeren.
    5. Gooi de blokkerende oplossing volledig uit de putjes en pipetteer vervolgens 300 μL wasoplossing per put en herhaal deze wasprocedure drie tot vier keer.
    6. Verwijder overtollige PBS door de plaat droog te tikken op een papieren handdoek.
    7. Breng in totaal 25 μL plasma of medium aan op elke put, behalve de lege put, en voeg 75 μL PBS toe als verdunningsmiddel om het uiteindelijke volume 100 μL te maken; voeg 100 μL PBS toe aan de lege put.
    8. Meng vervolgens de monsters op RT gedurende 10 s door de plaat op een shaker bij 250 tpm te plaatsen.
    9. Breng 2 μL 100-voudig verdund DNase I (0,03 mg/ml) aan op elk putje, inclusief het blanco putje (eindconcentratie van DNase I in het reactiemengsel: 0,6 μg/ml).
    10. Sluit de plaat af met een zelfklevende plastic afdekking en meng de monsters grondig bij RT gedurende 10 s door de plaat op een shaker bij 250 tpm te plaatsen.
      OPMERKING: Om de optimale omstandigheden voor DNA-vertering te beoordelen, hebben we bij het ontwikkelen van de test monsters geïncubeerd met MPO-geassocieerd DNA van patiënten met COVID-19 met 0-0,9 μg / ml DNase I gedurende 15 minuten bij RT en platen gebruikt die zijn gecoat met specifiek vangstantilichaam voor MPO of een soortgematcht iso-type controleantilichaam.
    11. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij RT.
    12. Verwijder de zelfklevende plastic afdekking en breng 1 μL van 0,5 M EDTA aan op elke put om de DNase-reactie te stoppen.
    13. Sluit de plaat opnieuw met een zelfklevende plastic afdekking en schud deze gedurende 15 s op RT door deze op een schudder bij 250 tpm te plaatsen.
    14. Incubeer de plaat vervolgens een nacht bij 4 °C om de eiwitcomponenten van de NET's te laten hechten aan de afvangantistoffen.
  3. Dag 3
    1. Verwijder de zelfklevende plastic afdekking en gooi de oplossing uit de putjes.
    2. Gooi de oplossing volledig uit de putjes en pipetteer vervolgens 300 μL van de wasoplossing per put en herhaal deze wasprocedure drie tot vier keer.
    3. Breng in totaal 100 μL van het verdunde peroxidase-geconjugeerde anti-DNA-detectieantilichaam aan op elk putje.
    4. Sluit de plaat goed af met een zelfklevende plastic afdekking en incubeer deze gedurende 1,5 uur bij RT.
    5. Gooi de oplossing volledig uit de putjes en pipetteer vervolgens 300 μL wasoplossing per put en herhaal deze wasprocedure drie tot vier keer.
    6. Verwijder voorzichtig de resterende oplossing.
    7. Breng in totaal 100 μL ABTS-substraatoplossing aan op elke put en bedek de plaat met een zelfklevende plastic afdekking.
    8. Incubeer de plaat in het donker bij RT gedurende 20-30 minuten op een shaker bij 250 tpm.
      OPMERKING: Controleer de plaat met intervallen van 5 minuten totdat de gewenste OD-metingen zijn verkregen.
    9. Voeg in totaal 50 μL 2 M zwavelzuur toe om de reactie te stoppen.
    10. Meng de vloeibare inhoud van de putjes door voorzichtig op de zijkant van de plaat te tikken.
    11. Schakel de microplaatlezer in en sluit deze aan op de computer.
    12. Open de softwaretoepassing op de computer.
    13. Maak op de statusbalk een nieuw experiment en geef het een naam.
    14. Stel alle volgende parameters in voor het lezen van platen: Leestype, Absorptie; Leesmodus, eindpunt; Golflengten, 2; Lm-1, 405 nm; Lm-2, 490 nm; Automatisch mixen & Blanking voor, Uit; Voorgelezen plaat, uit; Automatische kalibratie, Aan; Strips, Lees hele plaat; Kolomgolflengteprioriteit, Kolomprioriteit; Rijtuigsnelheid, Normaal; en Automatisch lezen, Uit.
    15. Plaats vervolgens de 96-putplaat met de monsters in de lade en sluit deze.
    16. Selecteer ten slotte de knop Lezen zodat de plaat onmiddellijk wordt gelezen.
    17. Lees de absorptie van elke put bij een golflengte van 405 nm met behulp van een microplaatlezer (gebruik in dit stadium een golflengte van 490 nm als referentie).
    18. Voer automatisch de absorptiewaarde van het testmedium alleen af van alle onbekende monsters en sla de gegevens op.
      OPMERKING: Gebruik een standaardcurve verkregen uit serieel verdunde NET-standaard om de relatieve concentratie van NET in het monster 1,14,15 te berekenen. Hier worden de eindresultaten gepresenteerd als "MPO- of NE-DNA-complexen (% van de NET-standaard)." De detectiegrens (LOD) werd als volgt berekend op basis van de standaardafwijking (SD) en de helling van de kalibratiecurve (S): LOD = 3,3(SD/S).

4. Statistieken

  1. Voer alle statistische analyses uit met behulp van geschikte statistische analysesoftware. Hier werd SigmaPlot v14.5 gebruikt. Percentages en continue variabelen worden weergegeven als de mediaan met het interkwartielbereik vanwege de scheve verdeling van de meeste parameters.
  2. Vergelijk de plasma MPO-DNA en NE-DNA niveaus tussen COVID-19 patiënten en gezonde controles met behulp van de Wilcoxon rank sum test. Gebruik correlatieanalyse om de relatie tussen optische dichtheid en het percentage NET-standaard te onderzoeken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Deze methode gebruikte een sandwich ELISA met anti-MPO, anti-NE en anti-DNA monoklonale antilichamen om MPO-geassocieerd en NE-geassocieerd DNA te meten (figuur 1). Bij deze methode werden de putjes van een microtiterplaat gecoat met een MPO-specifiek of NE-specifiek monoklonaal antilichaam om DNA-geassocieerd MPO en DNA-geassocieerd NE te vangen, evenals niet-DNA-geassocieerde MPO en NE. Om de intra-assay coëfficiënt van variabiliteit (CV) te berekenen, werden dubbele metingen uitgevoerd binnen dezelfde plaat voor 30 monsters verzameld van patiënten met COVID-19 en gezonde controles, en het %CV werd berekend als het gemiddelde van de dubbele metingen; om het CV tussen de tests (d.w.z. de consistentie van plaat tot plaat) te berekenen, werden twee soorten monsters van patiënten met COVID-19 en gezonde controles gemeten in quadruplicaat op 10 verschillende platen; om de specificiteit van deze test aan te tonen, werden verschillende concentraties MPO-DNA- en NE-DNA-complexen getest met behulp van platen bedekt met iso-type controleantilichamen in plaats van specifieke monoklonale antilichamen tegen MPO en NE; en om de gevoeligheid en lineariteit van de test te berekenen, werd een serieel verdunde NET-standaard gemaakt door geïsoleerde menselijke neutrofielen te stimuleren met PMA en milde DNase-vertering getest en werden de correlatiecoëfficiënt en detectiegrens (LOD) berekend.

De kalibratiecurven voor MPO-DNA en NE-DNA op basis van een serieel verdunde NET-standaard zijn weergegeven in figuur 2. Betrouwbare standaardcurven voor MPO-DNA en NE-DNA (respectievelijk R2 = 0,958 en 0,963) worden verkregen wanneer de absorptiewaarden de concentraties van respectievelijk 0,93 en 0,90 niet overschrijden. De LOD-waarden berekend op basis van de SD en de helling van de kalibratiecurve waren respectievelijk 0,132% en 0,126% voor MPO-DNA en NE-DNA (%NET-standaard).

De hoogste OD werd verkregen wanneer 0,6 μg/ml DNase I werd toegepast (figuur 3). Daarom was de DNA-vertering beperkt tot het toevoegen van een 0,6 μg / ml reactiemengsel van DNase I gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Wanneer de platen werden gecoat met het iso-type controleantilichaam in plaats van het specifieke monoklonale antilichaam tegen MPO, werden zeer lage OD-waarden (<0,09 absorptie-eenheden [AU]) gedetecteerd bij verschillende concentraties DNase I.

Om de intra-assay coëfficiënt van variabiliteit (CV) voor MPO-DNA en NE-DNA te berekenen, werden dubbele metingen uitgevoerd in 30 monsters van patiënten met COVID-19 en gezonde controles in dezelfde plaat; het %CV werd berekend aan de hand van het duplicaatgemiddelde. De intra-assay CV's voor MPO-DNA en NE-DNA waren respectievelijk 1,871 en 0,987 bij gezonde controles en respectievelijk 2,532 en 2,010 bij COVID-19-patiënten (tabel 1). De gemiddelde intra-assay CV's van MPO-DNA en NE-DNA waren respectievelijk 2,202 ± 0,467 en 1,497 ± 0,723 (gemiddelde ± SD) (tabel 1).

Om de inter-assay CV voor MPO-DNA en NE-DNA te berekenen, werden twee soorten monsters verzameld van patiënten met COVID-19 en gezonde controles gemeten in quadruplicaat op 10 verschillende platen om de plaat-tot-plaat consistentie te controleren. De gemiddelde inter-assay CV's van MPO-DNA en NE-DNA waren respectievelijk 6.524 ± 2.672 en 4.389 ± 0.923 (gemiddelde ± SD) (tabel 2).

Om de specificiteit van de capture-antilichamen tegen MPO-DNA- en NE-DNA-complexen te evalueren, hebben we verschillende concentraties MPO-DNA- en NE-DNA-complexen getest met behulp van platen bedekt met iso-type controleantilichamen in plaats van specifieke monoklonale antilichamen tegen MPO en NE. Tabel 3 laat zien dat de iso-type controle-antilichamen weinig reageerden met de MPO-DNA- en NE-DNA-complexen bij de verschillende concentraties (0,035 AE tot 0,078 AE en −0,007 AU tot 0,096 AE, respectievelijk).

De niveaus van MPO-DNA en NE-DNA in het supernatant van DNase-verteerde PMA-gestimuleerde neutrofielen werden gedefinieerd als 100% NET-standaard en de plasmamonstergegevens werden uitgedrukt als %NET-standaard. De niveaus van MPO-DNA (%NET-standaard) waren significant hoger in het plasma van patiënten met COVID-19 (n = 16; 29,1% [IQR, 25,8, 41,5]) dan in het plasma van gezonde controles (n = 10; 13,4% [IQR, 12,4, 14,8]), evenals de niveaus van NE-DNA (%NET-standaard) (46,4% [IQR, 32,7, 53,7] versus 12,1% [IQR, 9,9, 14,7], respectievelijk P < 0,01; Figuur 4).

Figure 1
Figuur 1: Basisstadia van een sandwichenzymgebonden immunosorbenttestmethode voor het meten van myeloperoxidase-DNA of neutrofiel elastase-DNA in monsters. (A) De putjes zijn bedekt met een anti-myeloperoxidase (MPO) of anti-neutrofiele elastase (NE) vangantilichaam. (B) De resterende eiwitbindingsplaatsen worden geblokkeerd door blokkerende middelen. C) Monsters die NE-geconjugeerd en MPO-geconjugeerd DNA bevatten, worden toegevoegd. (D) Beperkte DNase-vertering wordt uitgevoerd en het monster wordt in de putten geïncubeerd om te binden met het vangantilichaam. (E) Een secundair peroxidase-gelabeld anti-DNA-antilichaam wordt toegevoegd. (F) Ongebonden secundair peroxidase-gelabeld anti-DNA-antilichaam wordt verwijderd. (G) Het substraat 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazozine-6-sulfonzuur) wordt toegevoegd en de kleurontwikkeling wordt gecontroleerd. Afkortingen: ABTS = 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonzuur); MPO = myeloperoxidase; NE = neutrofiele elastase Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Lineariteit van de relaties tussen de intensiteitswaarden en de verschillende verdunningen van de neutrofiele extracellulaire valstandaard. Het supernatant van DNase-verteerde phorbol 12-myristate 13-acetaat-gestimuleerde neutrofielen werd serieel verdund en de niveaus van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA werden getest om een kalibratiecurve te genereren. De absorptie-eenheden (AU) verkregen uit de onverdunde neutrofiele extracellulaire valstandaard (NET-standaard) werden toegewezen als 100%NET, en het uitzetten van de intensiteitswaarde bij 405 nm tegen de %NET-standaard onthulde een lineaire relatie. Afkortingen: MPO = myeloperoxidase; NE = neutrofiele elastase; NET = neutrofiele extracellulaire val Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Dosis-respons van DNase I in neutrofiele extracellulaire trap-DNA vertering. Het monster werd ingebracht in met myeloperoxidase gecoate putten. Vervolgens werd DNase I (0 μg/ml, 0,3 μg/ml, 0,6 μg/ml of 0,9 μg/ml) toegevoegd. Na 15 minuten vertering werd de enzymactiviteit gestopt en werden de resterende stappen van de sandwich-enzymgebonden immunosorbenttest dienovereenkomstig uitgevoerd. De gegevens worden weergegeven als het gemiddelde ± SD. N = 12. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Plasmaspiegels van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen bij patiënten met COVID-19. De gegevens worden uitgedrukt als percentages van neutrofiele extracellulaire val standaard (NET-standaard) inhoud en gepresenteerd als medianen en interkwartielbereiken. Patiënten met COVID-19, n = 16; gezonde controles, n = 10. ** P < 0,01 versus gezonde controles. Afkortingen: HC = gezonde controles; NET = extracellulaire val van neutrofielen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Intra-assay variabiliteitscoëfficiënt. Dertig monsters werden in tweevoud gemeten om individuele variabiliteitscoëfficiënten te controleren en zo de intra-assaycoëfficiënt van variabiliteit te bepalen. Afkortingen: AU = absorptie-eenheden; CV = variabiliteitscoëfficiënten Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Inter-assay coëfficiënt van variabiliteit. De monsters werden gemeten in quadruplicaat op 10 verschillende platen om de variatie van plaat tot plaat te controleren en zo de variabiliteitscoëfficiënt tussen de assays te bepalen. Afkortingen: AU = absorptie-eenheden; CV = variabiliteitscoëfficiënt. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Specificiteitstest voor capitatieantistoffen. De platen werden gecoat met iso-type controleantilichamen voor anti-myeloperoxidase (MPO) en anti-neutrofiele elastase (NE) om de specificiteit van de vangstantistoffen voor de MPO-DNA- en NE-DNA-complexen te evalueren. Afkortingen: AU = absorptie-eenheden; MPO = myeloperoxidase; NE = neutrofiele elastase Klik hier om deze tabel te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

We hebben een sandwich ELISA-methode beschreven waarbij MPO of NE bindt aan één plaats van het vangantilichaam tijdens de eerste incubatie van monsters die MPO-DNA- of NE-DNA-complexen bevatten. Na het wassen wordt de "sandwich" voltooid door de monsters te incuberen met een peroxidase-geassocieerd anti-DNA monoklonaal antilichaam. Na de verwijdering van ongebonden secundair antilichaam wordt het gebonden peroxidaseconjugaat gedetecteerd door de toevoeging van een chromogeen ABTS-peroxidasesubstraat, dat een oplosbaar eindproduct oplevert dat spectrofotometrisch kan worden gelezen bij 405 nm. De goede lineariteit en hoge inter-assay en intra-assay precisie geven aan dat de ELISA-assay beschreven in dit artikel en andere 1,2 betrouwbaar en haalbaar is voor klinische toepassing. Bovendien, wanneer het supernatant van met DNase behandelde PMA-gestimuleerde neutrofielen wordt toegewezen als een maximaal signaal voor de NET-standaard, kan deze ELISA-test worden gebruikt als een semi-kwantitatieve methode 1,14,15.

De lange chromatinedraden van NET's zijn versierd met MPO- en NE-eiwitten. Om de binding tussen het vangantilichaam en de MPO- DNA- of NE-DNA-complexen te vergroten, worden de draden in kortere stukjes gesneden door beperkte DNA-vertering met het enzym DNase; de toevoeging van een te hoge DNaseconcentratie kan leiden tot overmatige vertering van het DNA en dus een afname van de absorptie. De resultaten van een voorlopig experiment (zie figuur 3) toonden aan dat een passende hoeveelheid DNase-toevoeging nodig is om de restanten afkomstig van NET's los te maken. De experimenten die iso-type controleantilichamen gebruikten in plaats van specifieke vangstantistoffen toonden aan dat de vangstantistoffen die in deze test werden gebruikt, specifiek waren voor MPO-DNA- en NE-DNA-complexen.

Het vroege stadium van NET-vorming wordt gekenmerkt door gedecondenseerd chromatine en het behoud van de intensiteit van het plasmamembraan 9,16,17. Neutrofielen met een gecondenseerde kern zijn geïdentificeerd als neutrofielen die NET-vorming ondergaan en kunnen worden gekwantificeerd door flowcytometrie10. Hoewel flowcytometrie in korte tijd een groot aantal beelden van cellen kan analyseren, kan het niet worden gebruikt om de latere stadia van NET-vorming na celmembraanruptuur en de extrusie van chromatine te evalueren. Citrullinated histonen H3, waarvan bekend is dat ze NET-specifieke markers zijn, kunnen worden gedetecteerd door western blotting18 en ELISA19; Deze methoden zijn echter alleen specifiek voor PAD4-gerelateerde NET-vorming en kunnen niet worden gebruikt om PAD4-onafhankelijke NET's20 te beoordelen.

De bevinding dat de niveaus van serum NET-restanten hoger waren bij patiënten met COVID-19 dan bij gezonde controles komt overeen met eerdere rapporten21,22. Deze bevinding suggereert dat neutrofiele activering, inclusief NET-vorming, een belangrijke rol kan spelen in de pathogenese van COVID-19.

Deze test heeft een beperking. Recente rapporten hebben aangetoond dat immuungerelateerde genen, waaronder MPO en ELANE, die respectievelijk coderen voor MPO en NE, sterk tot expressie komen onder ongecontroleerde ontstekingsaandoeningen23 en positief gecorreleerd zijn met de ernst en mortaliteit van de ziekte24. Aangezien MPO en NE betrokken zijn bij de vorming van NET's onafhankelijk van die enzymatische activiteiten15, kunnen verhoogde eiwitniveaus van NE en MPO in neutrofielen de resultaten van deze test beïnvloeden.

We concluderen dat deze sandwich ELISA-methode direct extracellulair DNA meet met korreleiwitten, waaronder NE en MPO, die specifiek zijn voor NET-vorming. Deze detectietest is een betrouwbare, zeer gevoelige en nuttige methode voor het onderzoeken van de kenmerken van NET's in menselijke monsters en kweeksupernatanten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle gegevens die tijdens dit onderzoek zijn gegenereerd en/of geanalyseerd, zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel. De auteurs verklaren dat ze geen tegenstrijdige belangen hebben.

Acknowledgments

De auteurs bedanken Dr. Huq Muhammad Aminul voor het verlenen van hulp bij het beoordelen van het manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Polymorphs Accurate Chemical and Scientific Corporation AN221725 Isolation of PMN's from human blood.
96-well microtiter plate Thermo Fisher Scientific 467466 flat bottom
ABTS buffer solution Sigma-Aldrich Merck 11 204 530 001 Contains sodium perborate, citric acid, and disodium hydrogen phosphate. 
ABTS tablets Sigma-Aldrich Merck 11 204 521 001  Each tablet contains 5 mg ABTS substrate and 60 mg vehicle substances.
Adhesive plastic cover, Axygen Thermo Fisher Scientific 14222348
Anti-MPO antibody Sigma-Aldrich Merck  07-496-I Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is rabbit.
Anti-NE antibody, clone AHN-10 Sigma-Aldrich Merck MABS461 Store at 2-8 °C. stable for 1 year. Host species is mouse.
Bovine serum albumin Biomedical Science BR-220700081 Albumin from bovine fraction V. Store at 2–8 °C. stable for 2 year.
DNase I New England BioLabs M0303M Store at -20 °C
IgG, rabbit, Isotype Control GENETEX, Inc. GTX35035 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
IgG1, mouse Isotype Control, clone Ci4 Merck  MABC002 Store as concentrated solution at 2–8 °C.
Lithium heparin blood collection tube Becton Dickinson and Company
Microplate mixer As one corporation NS-P
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax 190  Any microplate plate reader capable of reading wavelengths from 405–490 nm can use.
Microplate reader application Molecular Devices SoftMax pro
Peroxidase-conjugated anti-DNA antibody, Cell death Detection ELISA Roche Diagnostics 1154467500  bottle 2. Store at 2–8 °C. stable for 1 year.
Phorbol 12-myristate 13-acetate Sigma-Aldrich Merck P8139 Activation of PMN's from human blood.
Phosphate buffered solution Takara Bio T9181 Store at room temperature. Stable for 6 months.
SigmaPlot v14.5  Systat Software Inc. San Jose, CA, USA
Sodium azide Fujifilm Wako Chemicals 190-14901 Store at room temperature.
t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether Fujifilm Wako Chemicals 9002-93-1 Store at room temperature.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sil, P., Yoo, D. G., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High throughput measurement of extracellular DNA release and quantitative NET formation in human neutrophils in vitro. Journal of Visualized Experiments. (112), e52779 (2016).
  2. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunology Letters. 160 (2), 186-194 (2014).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nature Reviews Immunology. 18, 134-147 (2018).
  5. Chamardani, T. M., Amiritavassoli, S. Inhibition of NETosis for treatment purposes: Friend or foe. Molecular and Cellular Biochemistry. 477 (3), 673-688 (2022).
  6. Rao, A. N., Kazzaz, N. M., Knight, J. S. Do neutrophil extracellular traps contribute to the heightened risk of thrombosis in inflammatory diseases. World Journal of Cardiology. 7 (12), 829-842 (2015).
  7. Sørensen, O. E., Borregaard, N. Neutrophil extracellular traps - The dark side of neutrophils. Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1612-1620 (2016).
  8. Abrams, S. T., et al. A novel assay for neutrophil extracellular traps (NETs) formation independently predicts disseminated intravascular coagulation and mortality in critically ill patients. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 200 (7), 869-880 (2019).
  9. Brinkmann, V., Goosmann, C., Kühn, L. I., Zychlinsky, A. Automatic quantification of in vitro NET formation. Frontiers in Immunology. 3, 413 (2012).
  10. Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. Journal of Immunological Methods. 423, 104-110 (2015).
  11. Masuda, S., et al. NETosis markers: Quest for specific, objective, and quantitative markers. Clinica Chimica Acta. 459, 89-93 (2016).
  12. Rada, B. Neutrophil extracellular traps. Methods in Molecular Biology. 1982, 517-528 (2019).
  13. Kano, H., Huq, M. A., Tsuda, M., Noguchi, H., Takeyama, N. Sandwich ELISA for circulating myeloperoxidase- and neutrophil elastase-DNA complexes released from neutrophil extracellular traps. Advanced Techniques in Biology & Medicine. 5 (1), 1000196 (2016).
  14. Prevel, R., et al. Plasma markers of neutrophil extracellular trap are linked to survival but not to pulmonary embolism in COVID-19-related ARDS patients. Frontiers in Immunology. 13, 851497 (2022).
  15. Schechter, M. C., et al. et al. extracellular trap (NET) levels in human plasma are associated with active TB. PLoS One. 12, e0182587 (2017).
  16. Papayannopoulos, V., Metzler, K. D., Hakkim, A., Zychlinsky, A. Neutrophil elastase and myeloperoxidase regulate the formation of neutrophil extracellular traps. Journal of Cell Biology. 191 (3), 677-691 (2010).
  17. Gupta, S., Chan, W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. Journal of Immunology. 200 (2), 869-879 (2018).
  18. Li, M., Lin, C., Leso, A., Nefedova, Y. Quantification of citrullinated histone H3 bound DNA for detection of neutrophil extracellular traps. Cancers. 12 (11), 3424 (2020).
  19. Thålin, C., et al. Quantification of citrullinated histones: Development of an improved assay to reliably quantify nucleosomal H3Cit in human plasma. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 18 (10), 2732-2743 (2020).
  20. Li, P., et al. PAD4 is essential for antibacterial innate immunity mediated by neutrophil extracellular traps. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1853-1862 (2010).
  21. Zuo, Y., et al. Neutrophil extracellular traps in COVID-19. JCI Insight. 5 (11), e138999 (2020).
  22. Masso-Silva, J. A., et al. Increased peripheral blood neutrophil activation phenotypes and neutrophil extracellular trap formation in critically ill Coronavirus disease 2019 (COVID-19) patients: A case series and review of the literature. Clinical Infectious Diseases. 74 (3), 479-489 (2022).
  23. Gong, F. C., et al. Identification of potential biomarkers and immune features of sepsis using bioinformatics analysis. Mediators of Inflammation. 2020, 3432587 (2020).
  24. Almansa, R., et al. Transcriptomic correlates of organ failure extent in sepsis. Journal of Infection. 70 (5), 445-456 (2015).

Tags

Immunologie en infectie Nummer 195
Kwantificeren van myeloperoxidase-DNA en neutrofiele elastase-DNA-complexen van neutrofiele extracellulaire vallen met behulp van een gemodificeerde sandwich-ELISA
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Islam, M. M., Salma, U., Irahara,… More

Islam, M. M., Salma, U., Irahara, T., Watanabe, E., Takeyama, N. Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA. J. Vis. Exp. (195), e64644, doi:10.3791/64644 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter