使用钙氟在苔藓中细胞壁动力学的 3-D 延时成像
Summary
这份手稿提出了一个详细的协议，用于对活苔藓组织的3-D细胞壁动力学进行成像，允许可视化 ggb 突变体中细胞壁的分离和野生型在长期发育过程中增厚的细胞壁模式。
Abstract
使用荧光显微镜的延时成像可以观察细胞和亚细胞水平的生长和发育的动态变化。通常，对于长时间的观察，该技术需要荧光蛋白的转化;然而，对于大多数系统来说，遗传转化要么耗时，要么在技术上不可用。本手稿介绍了一种在 3 天内使用钙荧光染料（在植物细胞壁中染色纤维素）对细胞壁动力学进行 3-D 延时成像的方案，该染料在苔藓 Physcomitrium patens 中开发。来自细胞壁的钙荧光染料信号稳定，可持续1周无明显衰减。使用这种方法，已经表明 ggb 突变体（其中蛋白质香叶基香叶基转移酶-I β亚基被敲除）中的细胞分离是由不受调节的细胞扩增和细胞壁完整性缺陷引起的。此外，钙荧光染色的模式随时间而变化;染色强度较低的区域与野生类型中未来的细胞扩增/分支位点相关。该方法可应用于许多其他包含细胞壁且可由钙氟染色的系统。
Introduction
植物细胞壁在细胞扩增和发育过程中发生动态变化1，2，3。保持细胞壁的完整性对于植物细胞在生长和发育过程中的粘附以及对环境信号的响应至关重要。尽管长时间可视化活细胞的细胞壁动力学对于了解细胞在发育和适应环境变化过程中如何保持粘附至关重要，但目前直接观察细胞壁动力学的方法仍然具有挑战性。
细胞变化的延时成像可以使用高分辨率荧光显微镜4，5，6，7提供生物体的信息发育动态。虽然延时3D成像在研究生长和发育过程中细胞形状的动态变化方面具有很大的潜力，但该技术通常需要荧光蛋白4，5，6，7的转化。然而，对于大多数系统来说，遗传转化要么耗时，要么在技术上具有挑战性。作为替代方案，附着在细胞成分上的荧光染料早已可用。荧光染料在用一定波长的光照射后可以发出荧光。常见的例子是Edu，DAPI，PI，FM4-64和Calcofluor白色8，9，10。然而，一个主要缺点是这些染料通常只能用于固定组织或短期实验，部分原因是它们对细胞8，9，10造成的伤害。
使用此处介绍的方案，在苔藓P. patens的延时实验期间，当钙荧光白在培养基中混合时，钙氟信号是稳定的。使用这种方法，使用3-D延时成像在3天内观察到ggb突变体中细胞的分离3（图1）。该方法可应用于许多其他包含细胞壁且可由钙氟染色的系统。
Protocol
Representative Results
Discussion
延时3-D重建或4-D成像是观察发育过程中细胞形态动态的有力工具。在该协议中，通过在培养基中混合钙荧光白色，可以在苔藓 P. patens中观察到3-D细胞形态的动力学。使用这种方法，我们观察到 ggb 突变体的细胞壁表面在发育过程中被撕裂3。此外，细胞壁增厚的减少与野生型细胞扩增/分支位点相关，可以预测扩增/分化位点。此外，由于钙荧光白可以与其他染料（例?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
作者感谢路易斯维尔大学的Soucy Patricia博士和Betty Nunn博士在共聚焦显微镜方面的帮助。这项工作由美国国家科学基金会（1456884至MPR）和国家科学基金会合作协议（1849213至MPR）资助。
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
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