Cirurgia e Testes Comportamentais no Modelo de Transposição do Neuroma Tibial em Ratos

Summary

Este protocolo descreve o modelo de transposição do neuroma tibial, que envolve uma lesão do nervo tibial com subsequente transposição da extremidade proximal do nervo para uma posição subcutânea pré-tibial ou lateral. O teste comportamental da dor do neuroma e da hiperalgesia plantar é quantificado usando monofilamentos de Von Frey.

Abstract

A transposição do neuroma tibial (TNT) é um modelo de rato no qual a alodínia no sítio do neuroma (nervo tibial) pode ser avaliada independentemente da alodínia na superfície plantar da pata traseira inervada pelo nervo sural intacto. Esse modelo de TNT é adequado para testar terapias para a dor do neuroma, como a potencial superioridade de certas terapias cirúrgicas já utilizadas na clínica, ou para avaliar novos fármacos e seu efeito nas duas modalidades de dor no mesmo animal. Nesse modelo, uma lesão distal (neurotmese) é feita no nervo tibial, e a extremidade proximal do nervo é transposta e fixada subcutânea e pré-tibialmente para permitir a avaliação do sítio do neuroma com um monofilamento de Von Frey de 15 g. Para avaliar a alodínia sobre o nervo sural, os monofilamentos de Von Frey podem ser usados pelo método ascendente-descendente na região lateral plantar da pata traseira. Após o corte do nervo tibial, a hipersensibilidade mecânica se desenvolve no local do neuroma dentro de 1 semana após a cirurgia e persiste pelo menos até 12 semanas após a cirurgia. A alodínia na superfície plantar inervada sural desenvolve-se dentro de 3 semanas após a cirurgia em comparação com o membro contralateral. Com 12 semanas, um neuroma se forma na extremidade proximal do nervo tibial seccionado, indicado por dispersão e turbilhonamento de axônios. Para a cirurgia modelo TNT, múltiplos passos críticos (micro)cirúrgicos precisam ser seguidos, e alguma prática cirúrgica sob anestesia terminal é aconselhada. Em comparação com outros modelos de dor neuropática, como o modelo de lesão nervosa poupada, a alodínia sobre o sítio do neuroma pode ser testada independentemente da hipersensibilidade do nervo sural no modelo TNT. No entanto, o sítio do neuroma pode ser testado apenas em ratos, não em camundongos. As dicas e orientações fornecidas neste protocolo podem ajudar grupos de pesquisa que trabalham com dor a implementar com sucesso o modelo de TNT em seu serviço.

Introduction

Cada ferida, variando de simples lacerações a amputação de membros inteiros, é acompanhada por graus variados de lesão nervosa periférica. Tal lesão nervosa pode resultar na formação de um neuroma, um emaranhamento desorganizado de fibras nervosas brotantes. Os neuromas tornam-se dolorosos em 8%-30% dos pacientes, afetando severamente sua qualidade de vida 1,2,3,4,5. Após a amputação do membro, a dor do neuroma desenvolve-se em 50% dos pacientes ^6,7,8. Os sintomas relatados incluem sensibilidade, dor espontânea, alodínia, hiperalgesia e hipersensibilidade mecânica ou térmica na área inervada⁹. Quando não tratada adequadamente em 1 ano, a dor do neuroma pode evoluir para um estado de dor crônica, resultando em alta carga social e custos médicos associados 10,11,12,13,14. Devido à baixa eficácia das intervenções farmacológicas atuais, a dor do neuroma é tratada preferencialmente pela remoção cirúrgica do neuroma doloroso, e o nervo tratado por várias técnicas cirúrgicas, como descrito na literatura¹⁵. É importante ressaltar que o alívio completo da dor é raro, a dor geralmente piora com o tempo e 40% dos pacientes não se beneficiam da cirurgia, indicando que novos tratamentos são necessários ^1,16.

Um modelo padronizado de dor no rato auxilia na compreensão dos mecanismos que conduzem a dor do neuroma e pode ajudar a identificar novos tratamentos ou avaliar os já existentes usados na clínica. O modelo de transposição do neuroma tibial (TNT) foi descrito pela primeira vez por Dorsi e col. em 2008¹⁷ e tem sido utilizado por diferentes grupos de pesquisa^18,19,20. O objetivo geral deste método é ser capaz de testar diferentes técnicas de tratamento para a dor do neuroma. A vantagem do modelo sobre, por exemplo, o modelo de lesão nervosa poupada (SNI)²¹, é que ele permite testar a alodínia no sítio do neuroma. Isso porque o modelo envolve a transposição da terminação nervosa proximal do nervo tibial para uma posição pré-tibial subcutânea, onde pode ser sondado com monofilamentos de von Frey. Além disso, a alodínia se desenvolve na superfície plantar da pata traseira inervada pelo nervo sural intacto, o que pode ser avaliado independentemente da dor do neuroma no mesmo animal. Isso é semelhante aos sintomas de dor do neuroma em pacientes, onde a dor neuropática persistente após a remoção de um neuroma doloroso às vezes é causada pelos nervos vizinhos²². Além disso, a alodínia sobre um nervo seccionado com neuroma é uma modalidade de dor diferente da alodínia sobre o nervo vizinho intacto. Assim, esse modelo facilita a avaliação do efeito de novas terapias tanto na alodínia presente no sítio do neuroma quanto na dor neuropática mais disseminada testada na superfície plantar da pata traseira. Como a cirurgia realizada para criar o modelo TNT pode ser desafiadora, este artigo elabora o procedimento para apoiar os pesquisadores na implementação do modelo em suas instalações.

Protocol

Esta pesquisa foi realizada de acordo com o IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) e as diretrizes para pesquisa animal, projeto número AVD1150020198824. 1. Medições basais de Von Frey Antes da cirurgia, realizar as medidas basais de acordo com o procedimento de teste de Von Frey, descrito abaixo nas seções 5 e 6. 2. Anestesia e preparo NOTA: Este estudo foi realizado em 15 ratos ma…

Representative Results

A avaliação no sítio do neuroma mostrou aumento da sensibilidade à aplicação do monofilamento de von Frey 15 g. No início do estudo, os ratos tipicamente responderam a 10%-15% (± 13%) das 25 aplicações de um monofilamento de 15 g. A taxa de resposta aumentou para 45%-50% (± 24%) 1 semana após a cirurgia de TNT. No lado contralateral, o número de respostas após a cirurgia foi semelhante ao basal (Figura 2A). Cerca de 20% dos ratos não desenvolveram neuroma doloroso; a taxa de r…

Discussion

Etapas críticas do protocolo
O modelo TNT envolve cortar o nervo tibial e transpô-lo lateral e subcutaneamente para um local pré-tibial para permitir o teste de sensibilidade do neuroma, além de hiperalgesia plantar sobre o nervo sural. No modelo TNT, é fundamental que o local do neuroma seja visível para os pesquisadores. Portanto, uma cepa de rato albino é preferida porque as suturas subcutâneas são facilmente visíveis através da pele e a cor da sutura deve ser preferencialmente azul escu…

Materials

Aesthesio	Linton Instrumentation	514007 until 514015	0.6 g until 15 g monofilaments
Carprofen	Local Veterinary Pharmacy	n/a	The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution
Cotton swabs	Nobamed	974255
Electrocautery	Fine Science Tools	18010-00
Ethanol 70%	Interchema BV	400406
Ethilon 4.0	Johnson & Johnson	1854G	IMPORTANT: the color should be blue or black
Ethilon 8.0	Johnson & Johnson	BV130-5
Isoflo, isoflurane Zoetis	Dechra Veterinary Products	B506
Mesh bottom cages	StoeltingCo	57816 and 57824
Micro forceps	Fine Science Tools	11251-35
Micro needle holder	Fine Science Tools	12076-12
Micro scissors	Fine Science Tools	15019-10
Micro tweezers	Fine Science Tools	11254-20
NaCl 0.9%	Trademed	H7 1000-FRE
Needle holder	Fine Science Tools	12004-16
Ophthalmic ointment	Local Veterinary Pharmacy	n/a	The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment
Scalpel	Fine Science Tools	10003-12
Scissors	Fine Science Tools	14001-12
Stereo surgical microscope	Leica	A60 F
Sterile sheet with hole	Evercare OneMed	1555-01
Surgical blade nr.15	Fine Science Tools	10015-00
Tweezers	Fine Science Tools	11617-12