JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biology

Tek Hücreli Dizileme için Nil Tilapia Bağırsağından Tek Hücreli Süspansiyon Hazırlığı

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64688
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea,Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery,Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science,Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine,Suez Canal University

Summary

Burada, tek hücreli dizileme için yüksek kaliteli tek hücreli bir tilapia bağırsağı süspansiyonunun hazırlandığını gösteriyoruz.

Abstract

Nil tilapyası, dünya çapında en yaygın kültüre alınmış tatlı su balığı türlerinden biridir ve su ürünleri balık çalışmaları için yaygın olarak kullanılan bir araştırma modelidir. Yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonların hazırlanması, tek hücreli RNA veya genom dizilimi gibi tek hücreli seviyedeki çalışmalar için gereklidir. Bununla birlikte, su ürünleri yetiştiriciliği balık türleri, özellikle tilapia bağırsağı için kullanıma hazır bir protokol yoktur. Etkili ayrışma enzimleri doku tipine bağlı olarak değişir. Bu nedenle, minimum hasarla yeterli canlı hücre elde etmek için uygun enzim veya enzim kombinasyonunu seçerek doku ayrışma protokolünü optimize etmek esastır. Bu çalışma, Nil tilapia bağırsağından kollajenaz / dispaz enzim kombinasyonu ile yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için optimize edilmiş bir protokolü göstermektedir. Bu kombinasyon, sindirim sonrası hücre agregasyonunu azaltmak için sığır serum albümini ve DNaz kullanımı ile ayrışma için oldukça etkilidir. Hücre çıkışı,% 90 hücre canlılığı ve yüksek hücre konsantrasyonu ile tek hücreli dizileme gereksinimlerini karşılar. Bu protokol, diğer balık türlerinin bağırsaklarından tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için de değiştirilebilir. Bu araştırma, etkili bir referans protokolü sağlar ve su ürünleri yetiştiriciliği balık türleri için tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasında ek denemelere olan ihtiyacı azaltır.

Introduction

Hücreler organizmaların temel birimleridir. Toplu doku çalışmaları ile karşılaştırıldığında, tek hücre düzeyinde çalışmalar hücre heterojenliğini yansıtabilir ve daha yüksek çözünürlüklü bilgi sağlayabilir1. Son yıllarda, araştırmacılar memelilerde, zebra balıklarında ve diğer model organizmalarda genom, transkriptom, epigenom veya multi-omik çalışmalar için tek hücreli dizileme teknolojilerini tek hücreli seviyelerde uyguladılar ve büyük atılımlar bildirdiler 2,3,4,5,6,7 . Çoğu çalışma model organizmalara odaklanmış olsa da, ekonomik balık türlerinde tek hücreli dizileme için az sayıda referans protokolü veya ticari ayrışma kiti vardır, bu da su ürünleri yetiştiriciliği araştırmalarında tek hücreli dizilemenin uygulanmasını sınırlar. Bu nedenle, yüksek hücre canlılığına ve nükleik asit bütünlüğüne sahip yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonlar üreten doku ayrışma protokollerinin geliştirilmesi çok önemlidir.

Minimum hasarla yeterli sayıda canlı hücre elde etmek için doku ayrışma protokolünün uygun enzim veya enzim kombinasyonu ile optimize edilmesi esastır. Doku ayrışması için en etkili enzim doku tipine bağlı olarak değişir. Memelilerde, kollajenaz, dispaz, tripsin, papain, elastaz, hyaluronidaz, liberaz, accutaz ve trypLE 8,9 dahil olmak üzere memeli katı dokuları için tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için çeşitli enzimler kullanılmıştır. Mekanik bozulma ile birlikte tripsin sindirimi, balıklarda hücre kültürü için dokuları ayrıştırmak için yaygın olarak kullanılmıştır10,11,12,13,14. Tripsin ayrıca sıçan bağırsağı15 ve zebra balığı solungaç dokusu16’da doku ayrışması için sindirim kokteyline kullanılmış veya eklenmiştir. Bununla birlikte, çeşitli nedenlerden dolayı, tripsin tek hücreli dizileme için en iyi seçenek değildir. Tek başına tripsin genellikle doku ayrışması için etkisizdir. Ek olarak, tripsin DNA ipliğinin17,18 kırılmasını ve RNA yıkımının19’u indükler.

Papain, hücreler arasındaki sıkı kavşakları oluşturan proteinleri bozar. Memeli sinir ve düz kas hücrelerinde, papain diğer proteazlardan daha verimli ve daha az yıkıcıdır20,21. Bununla birlikte, tripsin gibi, papain, enzimatik sindirim sırasında meydana gelen hücre lizisi nedeniyle hücrelerin serbest DNA kaynaklı toplanmasına neden olur9. Elastaz, tipik olarak ciltte, akciğerlerde, bağlarda, tendonlarda ve vasküler dokularda bulunan elastini parçalamaktadır22. Genellikle akciğer dokusunu ayırmak için kollajenaz, dispaz veya tripsin ile kombinasyon halinde kullanılır8. Hyaluronidaz hyaluronan’ın glikosidik bağlarını parçalayarak çeşitli bağ dokularında ve ciltte hücre dışı matriksin sindirimine katkıda bulunur 9,23.

Genel olarak, kollajenaz ve dispaz hücre dışı matriks parçalanması için iyi seçeneklerdir. İnsan, fare ve zebra balığı bağırsaklarının ayrışmasında kullanılmıştır24,25,26,27. Kollajenaz, kollajendeki peptit bağını yok eder, hücre dışı matrisin sindirimini teşvik eder ve hücreleri süspansiyona bırakır ve bu nedenle kollajenaz genellikle karaciğer 28,29, dalak30, pankreas31 ve bağırsak25 dahil olmak üzere insan ve fare katı doku ayrışması için kullanılır . Dispoz, polar olmayan amino asit kalıntılarının N-terminal peptid bağlarını hidrolize eden ve kollajenazdan daha hafif olan bir proteazdır. Fibronektin, tip IV kollajen ve daha az ölçüde tip I kollajen gibi hücre dışı matriks bileşenlerini, hücre-hücre kavşaklarını etkilemeden ayırır. Dispaz, bağırsak25,32, beyin33, karaciğer34, vb. gibi doku ayrışması için ayrı ayrı veya diğer enzimlerle birlikte kullanılır. Ek olarak, liberaz, accutaz ve trypLE dahil olmak üzere ticari olarak temin edilebilen sindirim kokteylleri, özellikle cilt, karaciğer ve böbrek 8,9 için katı doku ayrışması için iyi alternatiflerdir.

Nil tilapiası (Oreochromis niloticus), Perciformes takımının Cichlidae familyasına aittir. Tropikal ve subtropikal bölgelerde en çok kültürlü tatlı su balığı türlerinden biridir ve 2022 yılında yıllık 4,5 milyon ton üretim gerçekleştirmiştir35. İyi açıklamalı bir genoma sahip en iyi çalışılmış su ürünleri yetiştiriciliği balık türlerinden biridir. Nil tilapyası, kısa üretim süresi, yetiştirme kolaylığı ve çok çeşitli yetiştirme ortamlarına adaptasyonu nedeniyle su ürünleri yetiştiriciliği balık türleri için ideal bir araştırma modelidir. Bağırsak, beslenme, sindirim ve emilim, metabolizma ve mukozal bağışıklık organı olduğu için büyük araştırma ilgi çekicidir. Bağırsak, mikrobiyal popülasyonların yaşam alanıdır ve önemli bir bağışıklık dokusudur36. Makrofajlar, B hücreleri, granülositler ve T hücreleri dahil olmak üzere çok sayıda immün hücre tipinin varlığı nedeniyle immünolojik olarak aktiftir.

Bu çalışmada, su ürünleri balık türlerinde tek hücreli seviye çalışmalarını kolaylaştırmak için Nil tilapia bağırsağından yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için bir protokol geliştirdik. Bu dokuya özgü enzimlerin özelliklerine ve ön çalışmalara göre, kollajenaz / dispaz tilapia bağırsak dokusunun ayrışması için uygundur. Tek hücreli süspansiyonların hazırlanmasında göz önünde bulundurulması gereken son enzim tipi, apoptotik yollarıbaşlatmadan enzimatik sindirim sırasında ölü hücre lizisi yoluyla salınan serbest DNA’yı parçalayarak hücre agregasyonunu önleyen DNaz-I’dir 9 ve canlı hücre verimini arttırır36. Ek olarak, hücre kümelenmesini azaltmak ve hücre canlılığını artırmak için yıkama tamponuna sığır serum albümini (BSA) eklenir. Birçok reaktif şirketi BSA’yı bir enzim stabilizatörü olarak tanımlamaktadır. PBS’ye (fosfat tamponlu salin) %0,04-%1 BSA ilavesi, olumsuz etkileri olmayan tek hücreli dizileme süspansiyonları hazırlamak için bir yıkama çözeltisi geliştirmek için kullanılmıştır38. Düşük bir BSA oranının eklenmesi, hücre canlılığının korunmasına yardımcı olabilir ve hücre lizisi nedeniyle hücrelerin serbest DNA kaynaklı toplanmasını önleyebilir. Bu protokol aynı zamanda diğer su ürünleri balık türlerinin bağırsaklarından hücre ayrışma protokolleri geliştirmek için değerli bir referans sağlayabilir.

Protocol

Bu çalışma sırasındaki tüm hayvan protokolleri Hainan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (Protokol numarası: HNUAUCC-2022-00063; Onay tarihi: 2022-03-03). Bu deneyde kullanılan ekipman ve malzemelerin bir listesi Malzeme Tablosunda bulunabilir. Geçerli protokolün bir özeti Şekil 1’de gösterilmiştir. 1. Balık hazırlama Ortalama vücut ağırlığı 1…

Representative Results

Bu protokol, tek hücreli dizileme için Nil tilapia bağırsağının yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonunun hazırlanmasını açıklar (Şekil 1). Bu araştırma, kollajenaz / dispaz karışımının iyi bir ayrışma etkisine sahip olduğunu ve bağırsak dokusu için hafif olduğunu göstermektedir. Optimal sindirim enziminin seçimi, yüksek kaliteli tek hücreli bir süspansiyon hazırlamak için gereklidir. Ön çalışmada, yaygın olarak kullanılan birkaç enzimin ayrışm…

Discussion

Bu protokol, Nil tilapia bağırsağının yüksek kaliteli tek hücreli süspansiyonunun hazırlanmasını açıklar. Ayrışmadan önce, özellikle çok yağlı etçil balık bağırsakları için yağ ve mezenterin bağırsaktan çıkarılması gereklidir. Bağırsak içeriğini yıkamak için sert kazıma yerine bir şırınga kullanmak, hücrelere verilen mekanik hasarı azaltır. Hücre canlılığını sağlamak için, doku diseksiyonu ve durulama adımları için sıcaklığın 20 ° C veya altında tutulması da…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, Çin’in Hainan İl Doğa Bilimleri Vakfı’nın (NO. 320QN211) ve Çin’in Sucul Hayvan Hastalıkları Kontrolü ve Sağlıklı Kültürü Guangdong İl Anahtar Laboratuvarı Araştırma Fonu Programı’nın desteğini kabul etmek istiyor (NO. PBEA2021ZD01).

Materials

0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
  2. He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
  3. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  4. Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
  5. Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
  6. Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
  7. Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
  9. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
  10. Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
  11. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  12. Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
  13. Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
  14. Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
  15. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  16. Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
  17. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
  18. Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
  19. Vrtačnik, P., Kos, &. #. 3. 5. 2. ;., Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
  20. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  21. Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn’s colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
  22. Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
  23. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  24. Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
  25. Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
  26. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
  27. Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
  28. Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
  29. Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
  30. Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
  31. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  32. Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  33. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
  34. Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
  35. FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , (2022).
  36. Beck, B. H., Peatman, E. . Mucosal Health in Aquaculture. , (2015).
  37. Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
  38. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
  39. Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
  40. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  41. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  42. Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
  43. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).

Tags

Single-cell SuspensionNile TilapiaIntestineSingle-cell SequencingEnzymatic Cell DissociationCollagenase DispasePBSFBSIntestinal ContentsMucusBSA-DPBSRNA InhibitorCell Strainer

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, P., Zhou, Y., Wang, B., Elaswad, A., Wang, S., Guo, W., Zhang, D. Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (192), e64688, doi:10.3791/64688 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image