Summary
Her præsenterer vi en ikke-genetisk metode til at generere humane autologe leversfæroider ved hjælp af mononukleære celler isoleret fra steady-state perifert blod.
Abstract
Humane leverceller kan danne en tredimensionel (3D) struktur, der er i stand til at vokse i kultur i nogle uger og bevare deres funktionelle kapacitet. På grund af deres natur at klynge i kulturskålene med lave eller ingen klæbende egenskaber danner de aggregater af flere leverceller, der kaldes humane leversfæroider. Dannelsen af 3D-leversfæroider er afhængig af levercellernes naturlige tendens til at aggregere i fravær af et klæbende substrat. Disse 3D-strukturer har bedre fysiologiske reaktioner end celler, som er tættere på et in vivo-miljø . Brug af 3D-hepatocytkulturer har adskillige fordele sammenlignet med klassiske todimensionelle (2D) kulturer, herunder et mere biologisk relevant mikromiljø, arkitektonisk morfologi, der samler naturlige organer samt en bedre forudsigelse vedrørende sygdomstilstand og in vivo-lignende reaktioner på lægemidler. Forskellige kilder kan bruges til at generere sfæroider, som primært levervæv eller udødeliggjorte cellelinjer. 3D-levervævet kan også konstrueres ved hjælp af humane embryonale stamceller (hESC'er) eller inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er) til at udlede hepatocytter. Vi har opnået humane leversfæroider ved hjælp af blodafledte pluripotente stamceller (BD-PSC'er) genereret fra umanipuleret perifert blod ved aktivering af humant membranbundet GPI-bundet protein og differentieret til humane hepatocytter. De BD-PSC'er-afledte humane leverceller og humane leversfæroider blev analyseret ved lysmikroskopi og immunofænotypning ved anvendelse af humane hepatocytmarkører.
Introduction
I de senere år er tredimensionelle (3D) sfæroidkultursystemer blevet et vigtigt redskab til at studere forskellige områder af kræftforskning, lægemiddelopdagelse og toksikologi. Sådanne kulturer skaber stor interesse, fordi de bygger bro mellem todimensionelle (2D) cellekulturmonolag og komplekse organer1.
I mangel af en klæbende overflade sammenlignet med 2D-cellekulturen er dannelsen af sfæroider baseret på disse cellers naturlige affinitet til klyngedannelse i 3D-form. Disse celler organiserer sig i grupper bestående af en eller flere typer modne celler. Fri for fremmede materialer interagerer disse celler med hinanden som i deres oprindelige mikromiljø. Cellerne i 3D-kultur er meget tættere og har en ordentlig orientering mod hinanden med højere ekstracellulær matrixproduktion end 2D-kulturer og udgør et tæt på det naturlige miljø 2.
Dyremodeller er blevet brugt i lang tid til at studere menneskelig biologi og sygdomme3. I denne henseende er der iboende forskelle mellem mennesker og dyr, hvilket gør disse modeller ikke helt egnede til ekstrapolative undersøgelser. 3D-kultursfæroider og organoider repræsenterer et lovende værktøj til at studere vævslignende arkitektur, interaktion og krydstale mellem forskellige celletyper, der forekommer in vivo og kan bidrage til at reducere eller endda erstatte dyremodeller. De er af særlig interesse for at studere patogenesen af leversygdomme samt lægemiddelscreeningsplatforme4.
3D-sfærisk kultur er af særlig betydning for kræftforskning, da det kan eliminere diskontinuiteten mellem cellerne og deres miljø ved at reducere behovet for trypsinisering eller kollagenasebehandling, der er nødvendig for at forberede tumorcellemonolagene til 2D-kulturer. Tumorsfæroider muliggør undersøgelse af, hvordan de normale versus ondartede celler modtager og reagerer på signaler fra deres omgivelser5 og er en vigtig del af tumorbiologiske undersøgelser.
Sammenlignet med monolaget ligner 3D-kulturer, der består af forskellige celletyper, tumorvæv i deres strukturelle og funktionelle egenskaber og er derfor egnede til at studere metastase og invasion af tumorceller. Derfor bidrager sådanne sfæroidmodeller til at fremskynde kræftforskningen6.
Sfæroider hjælper også med at udvikle teknologien til at skabe humane organoider, fordi vævs- og organbiologi er meget udfordrende at studere, især hos mennesker. Fremskridt inden for stamcellekultur gør det muligt at udvikle 3D-kulturer som organoider bestående af stamceller og vævsstamfædre samt forskellige typer modne (vævs) celler fra et organ med nogle funktionelle egenskaber som et ægte organ, der kan bruges til at modellere organudvikling, sygdomme, men de kan også betragtes som nyttige i regenerativ medicin7.
Primære humane hepatocytter anvendes normalt til undersøgelse af in vitro-biologi af humane hepatocytter, leverfunktion og lægemiddelinduceret toksicitet. Kulturer af humane hepatocytter har to hovedulemper, for det første den begrænsede tilgængelighed af primært væv som humane hepatocytter, og for det andet hepatocytternes tendens til hurtigt at dedifferentiere i 2D-kultur og derved miste deres specifikke hepatocytfunktion8. 3D-leverkulturer er overlegne i denne henseende og er for nylig blevet fremstillet af differentierede humane embryonale stamceller (hESC'er) eller inducerede pluripotente stamceller (hiPSC'er)9. Bioengineered hepatiske 3D-sfæroider er af særlig interesse for at studere udvikling, toksicitet, genetiske og smitsomme sygdomme i leveren samt i lægemiddelopdagelse til behandling af leversygdomme10. Endelig har de også potentialet til at blive brugt klinisk, vel vidende at akutte leversygdomme har en dødelighed på næsten 80%, biokunstig lever og / eller hepatiske sfæroider kan potentielt redde disse patienter ved at give delvis leverfunktion, indtil en passende donor kan findes11.
Vi har etableret en protokol for generering af humane hepatiske sfæroider ved hjælp af blodafledte pluripotente stamceller (BD-PSC'er) til fremstilling af sfæroider af forskellig størrelse indeholdende 4000 til 1 x 106 celler og analyseret dem ved hjælp af lysmikroskopi og immunofluorescens. Vi testede også evnen til hepatocytspecifik funktion og vurderede ekspressionen af cytokrom P450 3A4 (CYP3A4) og 2E1 (CYP2E1) enzymer, der tilhører cytokrom P450-familien, der har vigtige roller i cellulær og lægemiddelmetabolisme gennem afgiftningsprocessen12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Der blev opnået etisk godkendelse (ACA CELL Biotech GmbH/25b-5482.2-64-1) til at udføre disse eksperimenter, og informeret samtykke blev underskrevet af alle donorer før blodekstraktion i overensstemmelse med institutionelle retningslinjer.
1. Fremstilling af mononukleære celler (MNC'er) fra humant perifert blod (PB)
- Uddrag 30 ml blod fra raske donorer ved hjælp af uddannet medicinsk personale i henhold til standardprotokollen.
- Isoler PBMNC'er ved hjælp af densitetsgradientmedier i henhold til protokollen offentliggjort af Becker-Kojić et al.13. Interfaselaget mellem plasma- og densitetsgradientmedier isoleres ved pipettering, og der anvendes sterilt fosfatbuffersaltvand (PBS) til vask af de isolerede celler.
- Brug et tællekammer og tæl antallet af celler ved hjælp af standardmetoder.
2. Dedifferentiering af MNC'er ved aktivering med humant GPI-forankret glycoprotein
- 6 x 106 mononukleære celler anbringes i PBS/1% bovint serumalbumin (BSA) i et polystyrenrør (15 ml) og inkuberes med det specifikke antistof i 30 minutter ved 37 °C ifølge Becker-Kojić et al.13.
- Centrifuger cellerne ved 300 x g ved stuetemperatur og erstat PBS/BSA med Iscoves modificerede Dulbeccos medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS).
- Cellerne dyrkes i 15 ml polystyrenrør i en 5% CO2 -inkubator ved 37 ° C i 8-10 dage som beskrevet i Becker-Kojić et al.13. På dag 5 (D5) tilsættes 1-2 ml Iscoves medium suppleret med 10% FBS til hvert 15 ml rør.
3. Sortering af nyligt genererede dedifferentierede celler
- Centrifugeret dyrket cellesuspension ved stuetemperatur i 10 minutter ved 300 x g og aspirer den resulterende supernatant med en steril pipette ifølge Becker-Kojić et al.13.
- Resuspender pellet opnået ved centrifugering i 90 μL kold PBS-buffer (PBS pH 7,2, 0,5 % BSA og 2 mM EDTA), og tilsæt 10 μL CD45-positive magnetiske perler i nanostørrelse og inkuber på is i 15 minutter.
- Cellesuspensionen vaskes med 2 ml PBS-buffer, centrifugeres ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur, og der tilsættes 500 μL PBS-buffer til cellerne, og cellerne resuspenderes grundigt.
- Der pipetteres 500 μL forkølet PBS-buffer ind i søjlen for at vaske og placere den i magnetfeltet ved hjælp af et magnetisk stativ.
- Cellerne placeret på søjlen vaskes to gange med 500 μL PBS-buffer og opsamles gennemstrømning indeholdende CD45-negative celler i Iscoves medium suppleret med 10% FBS.
- Brug et tællekammer til at bestemme antallet af omprogrammerede celler.
4. Fremstilling af glasdæksler til generering af humane hepatocytter
- Adskil glasdæksler (14 mm) og inkuber dem i nonionisk vaskemiddel i 10 min. Vask glasdæksler i deioniseret vand, indtil der ikke er bobler tilbage, og inkuber dem i 1M HCI i 30 minutter (tilpasset fra Marchenko et al.14).
- Vask glasdæksler med deioniseret vand mindst 3x og tør dem natten over ved stuetemperatur. Autoklave tørrede glasdæksler i en passende beholder.
5. Belægning af cellekulturplader med biolaminin til 2D leverdifferentiering af BD-PSC'er
- Læg autoklaverede glasdæksler med en steril pincet i 4 brøndplader, og tænd UV-lys i 30 minutter for at sikre sterile forhold.
- Der optøs alikvoter af biolaminin, og der tilsættes 120 μL 5 μg/ml biolaminin til hver glasdæksel. De coatede glasdæksler efterlades natten over ved 4 °C.
- Fjern overskuddet af biolaminin og tilsæt 200 μL hepatocytdifferentieringsmedium som beskrevet nedenfor.
6. Fremstilling af hepatocytdifferentieringsmedier
- Lav 500 ml hepatoblast knockout serum erstatning (KSR) / dimethylsulfoxid (DMSO) medium bestående af 76,4% knockout DMEM (KO-DMEM), 20% KSR, 0,5% L-glutamin, 1% ikke-essentielle aminosyrer (NEAA), 0,1% β-mercaptoethanol, 1% DMSO og 1% penicillin-streptomycin (Pen / Strep).
- Forbered 500 ml hepatocytmodningsmedium indeholdende 1% L-glutamin, 10 μM hydrocortison, 21-hemisuccinatnatriumsalt (HCC) og 1% Pen / Strep.
- Der anvendes en prøve substrat fra stammen, og der tilsættes frisk hepatocytvækstfaktor (HGF) og oncostatin M (OSM) i slutkoncentrationer på 10 ng/ml og/eller 20 ng/ml for hver mediumændring.
BEMÆRK: Oncostatin M er et cytokin, der tilhører interleukin 6-gruppen af cytokiner, vigtigt for hæmatopoiesis såvel som for leverudvikling.
7. Dyrkning af leverceller differentieret fra BD-PSC'er
- Sæt 3 x 105 BD-PSCS-celler i hver brønd i en 4-brønds plade belagt med biolaminin.
- 4-brøndpladerne anbringes i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2. Dyrk cellerne i 5 dage i KSR / DMSO hepatoblast medium, der understøtter endodermal differentiering og skift medium hver anden dag.
- Skift til hepatocytmodningsmedium på dag 5 og dyrk cellerne i yderligere 7-10 dage i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2. Skift mediet hver 48. time.
8.3D sfærisk hepatisk differentiering
- Tæl celler ved hjælp af et tællekammer.
- Centrifuger BD-dedifferentieret cellesuspension ved 300 x g i 10 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes og resuspenderes BD-dedifferentierede celler i KSR/DMSO-substrat ved 2 x 106 celler/ml.
- Før cellerne gennem en 40 μm cellesil for at sikre en enkeltcellesuspension og for at fjerne yderligere snavs.
- Tæl celler ved hjælp af et tællekammer og forbered et tilstrækkeligt volumen til hver cellesåningstæthed for at dispensere det krævede volumen pr. Brønd. Forbered en gradient med topsåning på 1 x 106 celler til en lav såtæthed på 4000 celler.
- Dispenser 100 μL KSR/DMSO-substrat i 96 brøndlave fastgørelsesplader, og tilsæt 100 μL cellesåningsfortynding.
- Placer lav fastgørelsesplade i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2 og dyrk dem i 5 dage.
- Skift 50% af mediet fra dag 3-4 efter såning, når sfæroiderne er tilstrækkeligt kompakte.
- På dag 5 ændres mediet til hepatocytmodningsmediet og dyrkes cellerne i yderligere 7-10 dage for yderligere modning. Skift mediet hver anden dag.
9. Immunofluorescensanalyse af nygenererede 2D-levercellekulturer
- Dyrk cellerne i henhold til differentieringsmetoden beskrevet ovenfor i 4, 8, 15 og 24 dage, og fjern medier.
- Inkuber celler med forvarmet fikseringsmiddel bestående af 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min. Kassér fikseringsmidlet og vask cellerne 2x med PBS i 5 minutter hver. Tilsæt straks 0,1% triton X-100-opløsning og permeabiliser cellerne i 5 minutter. Vask 2x med PBS.
- Tilsæt blokeringsopløsning lavet af PBS og 5% BSA og læg den på vippepladen i 1 time ved stuetemperatur.
- Fortynd primære antistoffer i fortyndingsbuffer 1% BSA / PBS som følger: albumin (ALB) 1:50, alfa-1 fetoprotein (AFP) 1:250, cytokeratin 18 (CK18) 1:50, hepatocytkernefaktor 4 alfa (HNF4α) 1:1000 og transthyretin (TTR) 1:50. Brug 50 μL antistoffortynding pr. Hul.
- Inkuber cellerne i 1 time ved stuetemperatur. Kassér derefter antistofopløsningen, vask cellerne i 5 minutter, og gentag vasketrin 3x.
- Forbered følgende sekundære antistoffer i fortyndingsbuffer: kanin anti-kylling IgG (Texas rød) 1:1000, ged anti-mus IgG (488) 1:1000 og ged anti-kanin (488) 1:500. Brug 50 μL antistoffortynding pr. brønd og inkuber cellerne i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne 3x med PBS i 5 min hver og monter dækslerne med monteringsmedier indeholdende DAPI til mikroskopisk analyse.
10. Levende farvning af nydannede leversfæroider
- Kassér forsigtigt kulturmedier, mens du ikke rører ved sfæroiderne, tilsæt frisklavet PBS med 0,1% triton X-100-opløsning og inkuber i 5 minutter for at permeabilisere cellerne.
- Sfæroider vaskes med substratet ved langsom pipettering i 5 min, gentag 2x.
- Spheroiderne inkuberes med de primære antistoffer ALB (1:50), AFP (1:250), CK18 (1:50), CYP2E1 (1:200) og CYP3A4 (1:200) fremstillet i PBS med 1 % BSA i 1 time i 5 % CO2 inkubator ved 37 °C. Brug 50 μL antistoffortynding pr. Hul.
- Fjern forsigtigt overskydende antistofopløsning og vask sfæroiderne med medium 3x.
- Forbered de tilsvarende sekundære antistoffer ged anti-mus IgG (Cy3), ged anti-mus IgG (488) og kanin anti-kylling IgG (Texas rød) ved en fortynding på 1:1000 og 1:500 for ged anti-kanin (488) i PBS i 1% BSA. Der anvendes 50 μL antistoffortynding pr. hul og inkuberes i 20 minutter i inkubatoren ved 37 °C og 5 % CO2.
- Vask forsigtigt 3x med medium og lad pladen stå i 30 minutter i inkubatoren ved 37 °C og 5% CO2 , før du udfører fluorescensmikroskopi.
11. Undersøgelse af sfæroider ved hjælp af et fluorescensmikroskop
- Tænd fluorescenslyskilden 10 minutter før brug, tænd computeren, og åbn billedbehandlingssoftwaren.
- Brug et mål med 4x forstørrelse, klik på knappen 4x i værktøjslinjen for at få valgt den korrekte skalabjælke, og placer derefter 96-brøndpladen på scenens midterplade.
- Tænd LED-lyskilden, brug brightfield-filteret, og placer pladen til den relevante brønd ved hjælp af trinjusteringsknappen på x-y-aksen.
- Skift til kameraets lyssti, klik på knappen Live i billedbehandlingssoftware for at visualisere billedet på skærmen og sikre, at kuglenoiden er centreret ved hjælp af x-y-akseknapperne og fokus ved hjælp af den grove / fine fokusknap.
BEMÆRK: Formen på sfæroiderne forbliver konstant efter påføring af levende farvning. - Vælg Brightfield Observation metode i værktøjslinjen, sæt eksponeringsindstillinger til automatisk, og klik på knappen Snapshot i kameraets kontrolpanel for at tage et billede. Gem derefter billedet som .vsi-fil ved hjælp af det relevante navn i mappen af interesse.
- Placer afskærmningspladen for omgivende lys for at slukke LED-lys, skift til filter for B-excitation, vælg 488 Observationsmetode i værktøjslinjen, åbn lukker, tag et billede ved at klikke på knappen Snapshot, luk lukkeren, og gem derefter filen som beskrevet ovenfor.
- Gentag dette med et filter for G-excitation ved hjælp af den relevante observationsmetode (Texas rød eller CY3). Gentag derefter hele proceduren for hver brønd af interesse.
- Pladen sættes tilbage i 5 % CO2 -inkubatoren ved 37 °C og dyrkes som beskrevet ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi differentierede med succes humane BD-PSC'er til endoderm / hepatiske stamceller og hepatocytter ved at anvende en totrinsprotokol. Morfologiske ændringer under leverdifferentieringsprocessen er vist i figur 1. BD-PSC'er differentieres i hepatocytter, der gennemgår tre forskellige faser. Det første trin repræsenterer differentieringen i endodermale celler L4, det andet differentiering til leverstamceller (hepatoblast) L8, der udviser en typisk polygonal morfologi, og den tredje modning til hepatocytter L15-L24.
Immunofluorescensanalyse blev udført for at bekræfte leverdifferentieringen af BD-PSC'er som vist i figur 2. Stærk ekspression af endoderm / human leverprogenitor markør, som alfa-fetoprotein (AFP), et vigtigt plasmaprotein i føtalt serum, hvis koncentration er meget lav i voksne organismer og derfor betragtes som en markør for hepatocytters forløber15 og transthyretin (TTR), et vigtigt skjoldbruskkirtelhormonbindende protein involveret i transport af thyroxin fra blodbanen til hjernen16 findes i cellerne i det første trin af leverdifferentieringsprocessen ved L4 til L8. Imidlertid falder deres ekspression ved L15, mens ekspressionen af albumin (ALB), det mest rigelige plasmaprotein, der hovedsageligt produceres af leveren og er fuldstændig kritisk for leverdifferentiering, såvel som hepatocytnuklear faktor 4 alfa (HNF-4α), en hepatocyttranskriptionsfaktor, der er involveret i ekspressionen af leverspecifikke gener17 vises først ved L4, stiger gennem differentieringstiden L4-L15 og når et stærkt og stabilt udtryk i modningstiden L15-L24.
Cytokeratin 18 (CK18) er et cytoskeletalt protein, en af hovedkomponenterne i mellemliggende filament udtrykt i leveren18. Resultaterne viser, at CK18-ekspression som forventet korrelerer med modne hepatocytter (L15-L24), og det udtrykkes ikke i hepatocytstamceller.
Den veldefinerede protokol for hepatocytdifferentiering i 2D-kulturer muliggør konstruktion af hepatiske 3D-kulturer, der starter med BD-PSC'er.
Vi demonstrerer her, at spontan aggregering af disse celler i lave fastgørelsesplader indeholdende hepatocytinduktions-/modningsmedium initierer sfærisk dannelse. Vækstsporet blev efterfulgt af billeddannelsesceller ved L2, L4 og L7. (Figur 3A) Der er en konsistent korrelation mellem sfærisk volumen og det variable antal celler, som vist i figur 3B.
Leveren er et organ, hvor de fleste stoffer i menneskekroppen metaboliseres. Cytokrom P450 er en superfamilie af enzymer (monooxygenaser), der er af afgørende betydning i processerne for lægemiddel- og cellulær metabolisme, afgiftning af xenobiotika og homeostase. For at vurdere den potentielle funktionelle aktivitet af BD-PSC'er afledte hepatiske sfæroider analyserede vi ekspressionen af lægemiddelmetaboliserende enzymer som CYP3A4 og CYP2E1, medlemmer af CYP3- og CYP2-familier19.
De fleste af de lægemidler, der anvendes i dag, herunder codein, cyclosporin A, erythromycin, acetaminophen, og diazepam samt mange steroider og kræftfremkaldende stoffer, metaboliseres på grund af aktiviteten af CY3A4 enzym20. CYP2E1 er involveret i metabolismen af endogene substrater som ethylenglycol, benzen, tetrachlormethan og især den vigtigste stærkt mutagene forbindelse som nitrosamin21.
De sfæroider, der dannes og differentieres i henhold til protokollen ved D14, levende farvet med antistoffer mod disse to enzymer, afslører den potentielle hepatiske funktionelle aktivitet af BD-PSC'er afledte sfæroider (figur 4).
Figur 1: Differentiering af BD-PSC'er til leverlignende celler. Repræsentative mikrografier af morfologiske ændringer gennem hepatisk differentiering af BD-PSC'er, der viser endodermal L4 eller polygonal form L8-morfologi, der endelig når modningstilstand ved L15 til L24. Skalabjælker: øverste række 50 μm, nederste række 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Immunofluorescensanalyse af BD-PSC'ers redifferentiering mod leverceller. Endoderm / hepatocytter stamfader og hepatocytter specifikke markører udtrykkes under leverdifferentiering af BD-PSC'er i 2D-kulturer. På dag L4 til L8 viser mikrografier nedsat ekspression af endoderm / hepatisk stamfader AFP og TTR, mens deres udtryk forsvandt fra L8-L24. Ekspression af hepatocytter ALB og HNFα markører opstår ved L4 og stiger under modning, mens ekspressionen af CK18 optrådte først ved L15 og nåede maksimum ved L24. Skalabjælker til grafer L4-L15: 50 μm og til L24: 20 μm. Kontrol er vist i supplerende figur 1. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Dannelse af 3D-sfæroider ved leverdifferentiering af BD-PSC'er. (A) Variable cellenumre af BD-PSC'er startende med 1 x 106 til 4000 celler blev podet i lave fastgørelsesplader, og differentiering blev udført i henhold til totrinsproceduren som anført i protokollen. Genereringen af 3D humane leversfæroider blev afbildet på forskellige tidspunkter, vist er repræsentative fasekontrastbilleder på hvert tidspunkt i kulturperioden. Skalastang: 200 μm. (B) Diametre på mindst 4 hepatiske sfæroider for hver størrelse blev målt ved L4 ved hjælp af mikroskopbilleddannelsessoftware, og volumener blev beregnet. Fejlbjælker viser standardafvigelse. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Hepatocytfunktionelle markører udtrykkes i BD-PSC'er-afledte leversfæroider. BD-PSC'er blev differentieret til hepatocytter. Direkte immunfluorescensanalyse blev udført på levende celler ved L14 ved anvendelse af antistoffer mod ALB, AFP, CK18 og CYP2E1 og CYP3A4, medlemmer af cytokrom P450-familien. Skalabjælke: 200 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: Negativ kontrol for immunfluorescensanalyse af BD-PSC'ers redifferentiering mod leverceller. Endoderm / hepatocytter stamfader og hepatocytter specifikke markører udtrykkes under leverdifferentiering af BD-PSC'er i 2D-kulturer. Vægtstang: 100 μm. Klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Leveren er et vigtigt organ i menneskekroppen med mange vigtige biologiske funktioner, såsom afgiftning af metabolitter. På grund af alvorlige leversvigt som skrumpelever og / eller viral hepatitis er der næsten 2 millioner dødsfald om året på verdensplan. Levertransplantationer ligger på andenpladsen inden for solide organtransplantationer på verdensplan, men kun ca. 10 % af det nuværende behov er opfyldt22.
Primære humane hepatocytter (PHH) bruges ofte til at studere levertoksicitet. Disse celler kan opretholdes i kultur i kort tid og bevare deres specifikke funktioner. Antallet af celler, der er tilgængelige fra en enkelt donor, er også begrænset, derudover kan disse celler ikke udvides i kulturen, derfor er manglen på donor-PHH fortsat den største hindring for hepatotoksicitetsundersøgelser. PSC'er udgør en fornyelseskilde til humant væv og kan anvendes til dannelse af leverkulturer i 3D11.
Lever 3D-kultursystemer viser flere fordele sammenlignet med 2D. Kortere differentieringstid og nøjagtig efterligning af in vivo-processer muliggør mere præcise undersøgelser af lægemiddelinduceret toksicitet, bedre forudsigelse af leveransvar og er mere omkostningseffektive23. Leversfæroidkulturerne på grund af deres autologe træk kan være en stor fordel i forhold til primære humane hepatocytter (PHH), der omgår ulemperne i forbindelse med deres anvendelse og kan blive en guldstandard til anvendelse i test af lægemiddeltoksicitet og har en potentiel fremtidig anvendelse i regenerativ medicin.
Vi har her demonstreret, at BD-PSC'er genereret fra steady-state perifert blod med succes kan differentieres til endodermale / hepatocytprogenitorer / modne hepatocytter med stabil albuminsekretion og fænotypisk stabilitet, der udtrykker hepatocytmarkører. Desuden demonstrerer de konstruerede 3D humane hepatocytsfæroidkulturer den potentielle funktionelle aktivitet ved at udtrykke de enzymer, der tilhører cytokrom P450, som CYP3A4 og CYP2E1.
Det vigtigste skridt i protokollen er at opnå god kvalitet og antal friske menneskelige multinationale selskaber til omprogrammeringsprocessen. Brugen af frosne MNC'er resulterer i et reduceret antal omprogrammerede celler.
Vi har konstrueret humane leversfæroider ved hjælp af aktiverede PBMNC-kulturer med og uden anvendelse af immunmagnetisk sortering, der adskiller omprogrammerede celler fra modne blodlegemer. Den lille forskel i brugen af disse to metoder er afhængig af den højere tæthed af 3D-struktur, når der anvendes rensede omprogrammerede celler. Ekspressionen af hepatocytmarkører forbliver konsistent i begge cellekulturpræparater.
På grund af den begrænsede tilgængelighed af PHH repræsenterer metoden potentielt det biologisk relevante nærmeste alternativ til autologe friske hepatocytter til undersøgelse af leverfunktion in vitro , som xenobiotiske metabolisme og levertoksicitet, værtspatogenintervention og cellebiologi generelt. Muligheden for at anvende BD-PSC'er i regenerativ medicin, samtidig med at de er autologe og ikke-teratogene, er genstand for yderligere undersøgelser i vores laboratorium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Den tilsvarende forfatter erklærer, at hun er patentindehaver relateret til nyt humant GPI-bundet protein. Hun er medstifter af og samarbejder med ACA CELL Biotech GmbH. De øvrige forfattere erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne er især taknemmelige for den tekniske bistand fra Oksana og John Greenacre. Dette arbejde blev støttet af ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Tyskland.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Albumin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500217 | produced in chicken |
| Albumin Fraction V | Carl Roth GmbH+Co. KG | T8444.4 | |
| Alpha-1 Fetoprotein | Proteintech Germany GmbH | 14550-1-AP | rabbit polyclonal IgG |
| Biolaminin 111 LN | BioLamina | LN111-02 | human recombinant |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano-sized magnetic beads |
| Cell Strainer | pluriSelect | 43-10040-40 | |
| CellSens | Olympus | imaging software | |
| Centrifuge tubes 50 mL | Greiner Bio-One | 210270 | |
| CEROplate 96 well | OLS OMNI Life Science | 2800-109-96 | |
| CKX53 | Olympus | ||
| Commercially available detergent | Procter & Gamble | nonionic detergent | |
| CYP2E1-specific antibody | Proteintech Germany GmbH | 19937-1-AP | rabbit polyclonal antibody IgG |
| CYP3A4 | Proteintech Germany GmbH | 67110-1-lg | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| Cytokeratin 18 | DakoCytomation | M7010 | mouse monoclonal antibody IgG1 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
| DPBS | Thermo Fisher Scientific | 14040091 | |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Discontinued. Available under: TMS-013-B |
| Glass cover slips 14 mm | R. Langenbrinck | 01-0014/1 | |
| GlutaMax 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | L-glutamine |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma-Aldrich | G588.2-50ML | |
| Goat anti-mouse IgG Cy3 | Antibodies online | ABIN1673767 | polyclonal |
| Goat anti-mouse IgG DyLight 488 | Antibodies online | ABIN1889284 | polyclonal |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A-11008 | |
| HCl | Sigma-Aldrich | 30721-1LGL | |
| HepatoZYME-SFM | Thermo Fisher Scientific | 17705021 | hepatocyte maturation medium |
| HGF | Thermo Fisher Scientific | PHG0324 | human recombinant |
| HNF4α antibody | Sigma-Aldrich | ZRB1457-25UL | clone 4C19 ZooMAb Rbmono |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate (sodium salt) | Biomol | Cay18226-100 | |
| Knock out Serum Replacement - Multi Species Gibco | Fisher Scientific | A3181501 | KSR |
| KnockOut DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660012 | Discontinued. Available under Catalog No. 10-828-010 |
| MACS Buffer | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi | 130-042-303 | magnetic stand |
| MEM NEAA 100x Gibco | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 31350010 | 50mM |
| MiniMACS columns | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Nunclon Multidishes | Sigma-Aldrich | D6789 | 4 well plates |
| Oncostatin M | Thermo Fisher Scientific | PHC5015 | human recombinant |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| PBS sterile | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9143.2 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom GmbH | A2213 | 10000 U/ml |
| PS 15ml tubes sterile | Greiner Bio-One | 188171 | |
| Rabbit anti-chicken IgG Texas red | Antibodies online | ABIN637943 | |
| Roti Cell Iscoves MDM | Carl Roth GmbH+Co. KG | 9033.1 | |
| Roti Mount FluorCare DAPI | Carl Roth GmbH+Co. KG | HP20.1 | |
| Roti Sep 1077 human | Carl Roth GmbH+Co. KG | 0642.2 | |
| Transthyretin antibody | Sigma-Aldrich | SAB3500378 | produced in chicken |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | 1% |
References
- Fennema, E., Rivron, N., Rouwkema, J., van Blitterswijk, C., de Boer, J. Spheroid culture as a tool for creating 3D complex tissues. Trends in Biotechnology. 31 (2), 108-115 (2013).
- Ryu, N. E., Lee, S. H., Park, H. Spheroid culture system methods and applications for mesenchymal stem cells. Cells. 8 (12), 1620 (2019).
- Nevzorova, Y. A., Boyer-Diaz, Z., Cubero, F. J., Gracia-Sancho, J. Animal models for liver disease - A practical approach for translational research. Journal of Hepatology. 73 (2), 423-440 (2020).
- Ingelman-Sundberg, M., Lauschke, V. M. 3D human liver spheroids for translational pharmacology and toxicology. Basic and Clinical Pharmacology and Toxicology. 130, Suppl 1 5-15 (2022).
- Nelson, C. M., Bissell, M. J. Of extracellular matrix, scaffolds, and signalling: tissue architecture regulates development, homeostasis, and cancer. Annual review of cell and developmental biology. 22, 287-309 (2006).
- Khanna, S., Chauhan, A., Bhatt, A. N., Dwarakanath, B. S. R. Multicellular tumor spheroids as in vitro models for studying tumor responses to anticancer therapies. Animal Biotechnology (Second Edition). , Academic Press. Chapter 13 251-268 (2020).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Riede, J., Wollmann, B. M., Molden, E., Ingelman-Sundberg, M. Primary human hepatocyte spheroids as an in vitro tool for investigating drug compounds with low clearance. Drug metabolism and disposition: The Biological Fate of Chemicals. 49 (7), 501-508 (2021).
- Soto-Gutierrez, A., et al. Differentiating stem cells into liver. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews. 25, 149-163 (2008).
- Hurrell, T., et al. Human liver spheroids as a model to study aetiology and treatment of hepatic fibrosis. Cells. 9 (4), 964 (2020).
- Chen, S., et al. Hepatic spheroids derived from human induced pluripotent stem cells in bio-artificial liver rescue porcine acute liver failure. Cell Research. 30 (1), 95-97 (2020).
- Zhao, M., et al. Cytochrome P450 enzymes and drug metabolism in humans. International Journal of Molecular Sciences. 22 (23), 12808 (2021).
- Becker-Kojić, Z. A., Schott, A. K., Zipančić, I., Hernández-Rabaza, V. GM-Free generation of blood-derived neuronal cells. Journal of Visualized Experiments. (168), e61634 (2021).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human neural stem cells. Journal of Visualized Experiments. (7), e267 (2007).
- Crandall, B. F.
- Magalhães, J., Eira, J., Liz, M. A. The role of transthyretin in cell biology: impact on human pathophysiology. Cellular and Molecular Life Sciences 2021. 78 (17-18), 6105-6117 (2021).
- Huck, I., Gunewardena, S., Espanol-Suner, R., Willenbring, H., Apte, U. Hepatocyte nuclear factor 4 alpha activation is essential for termination of liver regeneration in mice. Hepatology. 70 (2), 666-681 (2019).
- Korver, S., et al. The application of cytokeratin-18 as a biomarker for drug-induced liver injury. Archives of Toxicology. 95 (11), 3435-3448 (2021).
- Klyushova, L. S., Perepechaeva, M. L., Grishanova, A. Y. The role of CYP3A in health and disease. Biomedicines. 10 (11), 2686 (2022).
- Fujino, C., Sanoh, S., Katsura, T. Variation in expression of cytochrome P450 3A isoforms and toxicological effects: endo- and exogenous substances as regulatory factors and substrates. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 44 (11), 1617-1634 (2021).
- Hutchinson, M. R., Menelaou, A., Foster, D. J., Coller, J. K., Somogyi, A. A. CYP2D6 and CYP3A4 involvement in the primary oxidative metabolism of hydrocodone by human liver microsomes. British Journal of Clinical Pharmacology. 57 (3), 287-297 (2004).
- Asrani, S. K., Devarbhavi, H., Eaton, J., Kamath, P. S.
- Kammerer, S. Three-dimensional liver culture systems to maintain primary hepatic properties for toxicological analysis in vitro. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10214 (2021).
