מודל כריתה אפית בלב הבוגר Xenopus tropicalis
Summary
Xenopus tropicalis הוא מודל אידיאלי למחקר רגנרטיבי מכיוון שלרבים מאיבריו יש יכולת התחדשות יוצאת דופן. כאן אנו מציגים שיטה לבניית מודל של פגיעה בלב ב-X. tropicalis באמצעות כריתת קודקוד.
Abstract
ידוע כי אצל יונקים בוגרים, הלב איבד את יכולת ההתחדשות שלו, מה שהופך את אי ספיקת הלב לאחד הגורמים המובילים למוות ברחבי העולם. מחקרים קודמים הוכיחו את יכולת ההתחדשות של ליבו של הקסנופוס טרופיקליס הבוגר, דו-חי אנורי בעל גנום דיפלואידי וקשר אבולוציוני הדוק עם יונקים. בנוסף, מחקרים הראו כי לאחר כריתת קודקוד החדר, הלב יכול להתחדש ללא הצטלקות ב – X. tropicalis. כתוצאה מכך, תוצאות קודמות אלה מצביעות על כך ש – X. tropicalis הוא מודל חלופי מתאים לבעלי חוליות לחקר התחדשות לב בוגר. מודל כירורגי של התחדשות הלב אצל X. tropicalis הבוגר מוצג כאן. בקצרה, הצפרדעים הורדמו וקובעו; לאחר מכן, חתך קטן נעשה עם מספריים iridectomy, חודר את העור ואת קרום הלב. לחץ עדין הופעל על החדר, ואת קודקוד החדר נחתך אז עם מספריים. פגיעה לבבית והתחדשות אושרו על ידי היסטולוגיה ב 7-30 ימים לאחר כריתה (dpr). פרוטוקול זה ביסס מודל כריתה אפיקלי במבוגרים X. tropicalis, אשר ניתן להשתמש בו כדי להבהיר את מנגנוני התחדשות הלב הבוגר.
Introduction
אי ספיקת לב היא גורם תמותה מוביל בעולם בשנים האחרונות. מאז שנת 2000, מספר מקרי המוות עקב אי ספיקת לב גדל עם הזמן. יותר מ -9 מיליון אנשים מתו מקרדיומיופתיה בשנת 2019, שהיוותה 16% מכלל התמותה בעולם1. בשל אובדן יכולת ההתחדשות של הלב אצל יונקים בוגרים, במקרים מסוימים, אין מספיק קרדיומיוציטים כדי לשמור על תפקודי ההתכווצות בלב, מה שמשפיע על תפקוד הלב ותורם לעיצוב מחדש של חדרים ואי ספיקת לב 2,3,4. ואכן, אצל יונקים, ללב יש את יכולת ההתחדשות הירודה ביותר בהשוואה לאיברים אחרים, כגון הכבד, הריאות, המעיים, שלפוחית השתן, העצם והעור. ככל שהזדקנות אוכלוסיית העולם תהפוך למגה-מגמה עולמית, האתגרים העומדים בפנינו עם מחלות לב יתעצמו5.
להבהרת מנגנוני התחדשות הלב עשויות להיות השלכות משמעותיות על טיפולים במחלת לב איסכמית. דיווחים גילו כי ללבבות של עכברים ילודים יש יכולת התחדשות לאחר כריתה6 קודקוד. עם זאת, יכולת התחדשות זו אובדת לאחר 7 ימים של גיל7. מחקרים הראו כי לבבות יונקים בוגרים אינם מסוגלים להתחדש מכיוון שיכולתם להתפשטות קרדיומיוציטים פחתה 8,9. עם זאת, לבבות של חולייתנים נמוכים יותר יש יכולת התחדשות חזקה לאחר פציעה. לדוגמה, דגי זברה10, X. tropicalis11, Xenopus laevis12, newt 13 ו-axolotl14 מסוגלים להתחדשות מלאה לאחר כריתת קודקוד. בנוסף, חלקים אחרים של גופם של חלק מבעלי החוליות התחתונים יכולים גם הם לעבור התחדשות מלאה, כגון הגפיים של ניוטים והזנבות, העדשות והזרועות של צפרדעים טרופיותבעלות טפרים 4,15,16.
ביסוס מודלים של פגיעות לב הוא הצעד הראשון להבהרת המנגנונים העומדים בבסיס התחדשות הלב ויש לו משמעות רבה במחקר רגנרטיבי. חוקרים פיתחו שיטות שונות לבניית מודלים של פגיעות לב, כולל דקירה, קונטוציה, אבלציה גנטית, קריופציעה, אוטם 5,6.
Cryoinjury, אוטם שריר הלב (MI) וכריתת קודקוד נמצאים בשימוש נרחב לגרימת פגיעה לבבית, ולסוג הפציעה עשויות להיות השפעות משמעותיות על ההתחדשות הבאה של קרדיומיוציטים6. בהתאם לטכניקה הכירורגית, תגובת הלב להתחדשות עשויה להשתנות. Cryoinjury גורם למוות תאי מסיבי ומייצר צלקות פיברוטיות בליבם של דגי זברה17, ובכך יוצר מודל הדומה לאוטם יונקים. כריתה אפית מבוצעת על ידי חיתוך חלק מרקמות החדר, אשר נעשה בדגי זברה10 ו – X. tropicalis11, מבלי לגרום לצלקות קבועות. מחקר זה ביצע כריתה אפיקלית, שהיא פעולה פשוטה יותר ודורשת פחות כלי ניתוח מאשר cryoinjury. באמצעות ניתוח מעקב אחר שושלות, מחקר קודם הראה כי התחדשות הלב קשורה לשגשוג של קרדיומיוציטים הקיימים מראש בליבם של עכבר6 ודגי זברה18, אך לא קיימים דיווחים עבור דו-חיים. לפיכך, המודל של כריתת קודקוד ב- X. tropicalis ממלא תפקיד חשוב בהבהרת המנגנונים העומדים בבסיס תגובות רגנרטיביות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כריתה אפית, הכוללת קטיעה כירורגית של קודקוד הלב, תוארה בדגי זברה ובעכברים 6,18; עם זאת, זה לא תואר X. tropicalis. דו”ח זה מתאר מודל אמין של פגיעה לבבית ומדגים כי הלב של X. tropicalis בוגר יכול להתחדש באופן מלא לאחר כריתה אפית ללא צלקות. עם זאת, כמה חסרונות צריך לשפר, …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית המו”פ הלאומית של סין (2016YFE0204700), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070257, 81770240), ומענק המחקר של מעבדת מפתח לרפואה רגנרטיבית, משרד החינוך, אוניברסיטת ג’ינאן (ZSYXM202004 ו- ZSYXM202104), סין.
Materials
| Acetic acid | GHTECH | 64-19-7-500ml | |
| Acid Alcohol Fast Differentiation Solution | Beyotime | C0163M | |
| Acid Fuchsin | aladdin | A104916 | |
| Alcohol Soluble Eosin Y Stainin Solution | Servicebio | G1001-500ML | |
| BioReagent | Beyotime | ST2600-100g | |
| Ethanol absolute | Guangzhou Chemical Reagent Factory | HB15-GR-0.5L | |
| Hematoxylin Stain Solution | Servicebio | G1004-500ML | |
| Neutral balsam | Solarbio | G8590 | |
| Operating Scissors | Prosperich | HC-JZ-YK-Z-10cm | |
| Paraffins | Leica | 39601095 | |
| Para-formaldehyde Fixative | Servicebio | G1101-500ML | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) powder | Servicebio | G0002-2L | |
| Phosphomolybdic acid hydrate | Macklin | P815551 | |
| Stereo microscope | Leica | ||
| surgical forceps | ChangZhou | zfq-11-btjw | |
| Surgical Suture | HUAYON | 18-5140 | |
| Tricaine | Macklin | ||
| Xylene | Guangzhou Chemical Reagent Factory | IC02-AR-0.5L |
References
- Thiara, B. Cardiovascular disease. Nursing Standard. 29 (33), 60 (2015).
- van Amerongen, M. J., Engel, F. B. Features of cardiomyocyte proliferation and its potential for cardiac regeneration. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 12 (6), 2233-2244 (2008).
- Burke, A. P., Virmani, R. Pathophysiology of acute myocardial infarction. Medical Clinics of North America. 91 (4), 553-572 (2007).
- Sessions, S. K., Bryant, S. V. Evidence that regenerative ability is an intrinsic property of limb cells in Xenopus. Journal of Experimental Zoology. 247 (1), 39-44 (1988).
- Laflamme, M. A. Heart regeneration. Nature. 473 (7347), 326-335 (2011).
- Mahmoud, A. I., Porrello, E. R., Kimura, W., Olson, E. N., Sadek, H. A. Surgical models for cardiac regeneration in neonatal mice. Nature Protocols. 9 (2), 305-311 (2014).
- Tzahor, E., Poss, K. D. Cardiac regeneration strategies: Staying young at heart. Science. 356 (6342), 1035-1039 (2017).
- Porrello, E. R., et al. Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart. Science. 331 (6020), 1078-1080 (2011).
- Porrello, E. R., et al. Regulation of neonatal and adult mammalian heart regeneration by the miR-15 family. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (1), 187-192 (2013).
- Poss, K. D., Wilson, L. G., Keating, M. T. Heart regeneration in zebrafish. Science. 298 (5601), 2188-2190 (2002).
- Liao, S., et al. Heart regeneration in adult Xenopus tropicalis after apical resection. Cell & Bioscience. 7, 70 (2017).
- Marshall, L. N., et al. Stage-dependent cardiac regeneration in Xenopus is regulated by thyroid hormone availability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (9), 3614-3623 (2019).
- Witman, N., Murtuza, B., Davis, B., Arner, A., Morrison, J. I. Recapitulation of developmental cardiogenesis governs the morphological and functional regeneration of adult newt hearts following injury. Developmental Biology. 354 (1), 67-76 (2011).
- Cano-Martinez, A., et al. Functional and structural regeneration in the axolotl heart (Ambystoma mexicanum) after partial ventricular amputation. Archivos de Cardiología de México. 80 (2), 79-86 (2010).
- Kragl, M., et al. Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration. Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).
- Oberpriller, J. O., Oberpriller, J. C. Response of the adult newt ventricle to injury. Journal of Experimental Zoology. 187 (2), 249-253 (1974).
- Gonzalez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish. Development. 138 (9), 1663-1674 (2011).
- Ellman, D. G., et al. Apex resection in zebrafish (Danio rerio) as a model of heart regeneration: A video-assisted guide. International Journal of Molecular Sciences. 22 (11), 5865 (2021).
- Lee-Liu, D., et al. Genome-wide expression profile of the response to spinal cord injury in Xenopus laevis reveals extensive differences between regenerative and non-regenerative stages. Neural Development. 9, 12 (2014).
- Wu, H. Y., et al. Fosl1 is vital to heart regeneration upon apex resection in adult Xenopus tropicalis. npj Regenerative Medicine. 6 (1), 36 (2021).
- Chablais, F., Jazwinska, A. Induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury. Journal of Visualized Experiments. (62), e3666 (2012).
