Hier beschrijven we een eenvoudig te implementeren, gestandaardiseerd, microfysiologisch systeem dat de complexiteit van de in vivo structuur van het menselijk beenmerg weerspiegelt en een relevant model biedt om een breed scala aan normale en pathologische gebeurtenissen nauwkeurig te bestuderen.
De medullaire niche is een complex ecosysteem dat essentieel is om homeostase voor residente cellen te behouden. Inderdaad, het beenmerg, dat een complexe extracellulaire matrix en verschillende celtypen omvat, zoals mesenchymale stamcellen, osteoblasten en endotheelcellen, is diep betrokken bij hematopoëtische stamcelregulatie door directe cel-celinteracties, evenals cytokineproductie. Om deze in vivo structuur nauw na te bootsen en experimenten uit te voeren die de reacties van het menselijk beenmerg weerspiegelen, zijn verschillende 3D-modellen gemaakt op basis van biomaterialen, voornamelijk gebaseerd op primaire stromale cellen. Hier wordt een protocol beschreven om een minimaal en gestandaardiseerd systeem te verkrijgen dat eenvoudig op te zetten is en kenmerken biedt van een beenmergachtige structuur, die verschillende celpopulaties combineert, inclusief endotheelcellen, en de heterogeniteit van in vivo beenmergweefsel weerspiegelt. Deze 3D-beenmergachtige structuur – geassembleerd met behulp van op calciumfosfaat gebaseerde deeltjes en menselijke cellijnen, representatief voor de micro-omgeving van het beenmerg – maakt de monitoring van een breed scala aan biologische processen mogelijk door verschillende primaire celpopulaties binnen het systeem te combineren of te vervangen. De uiteindelijke 3D-structuren kunnen vervolgens worden geoogst voor beeldanalyse na fixatie, paraffine-inbedding en histologische / immunohistochemische kleuring voor cellokalisatie binnen het systeem, of gedissocieerd om elke cellulaire component te verzamelen voor moleculaire of functionele karakterisering.
Beenmerg (BM) wordt gevonden in zowel de centrale holtes van axiale als lange botten en trabeculaire platte botten en bevat een verscheidenheid aan verschillende cellulaire en niet-cellulaire componenten. Op structureel niveau bestaat het uit hematopoëtische weefseleilanden (ook wel “hematonen” genoemd)1,2 en vetcellen omgeven door vasculaire sinussen afgewisseld in trabeculair bot3. Bij lange en platte botten is de bloedtoevoer naar het bot en beenmerg met elkaar verbonden via een endsteaal netwerk van bloedvaten4. Verborgen in dit solide beschermende netwerk, herbergt de BM zeer onrijpe cellen ondergedompeld in een sponsachtig stroma en vormt de locatie voor de differentiatie van residente mesenchymale stamcellen (MSC’s) en hematopoëtische stamcellen (HSC’s)5. Inderdaad, afgezien van de vernieuwing van botweefsels door de productie van osteoblasten, bevindt een van de belangrijkste bekende functies van de BM zich in de ontwikkeling van hematopoëse6.
Het BM-hematopoietische weefsel omvat een verscheidenheid aan celtypen, namelijk HSC’s, voorlopers en meer gedifferentieerde bloedcellen zoals lymfocyten, neutrofielen, erytrocyten, granulocyten, monocyten en trombocyten7. Hematopoietische cellen zijn niet willekeurig gerangschikt in de BM-ruimte, maar vertonen een bepaalde organisatie binnen de hematopoietische niches, die veel celtypen van verschillende oorsprong omvatten (osteoblasten, osteoclasten, MSC’s, adipocyten, sinusoïdaal endotheel en perivasculair stromale cellen, immuuncellen, zenuwcellen en verschillende volwassen hematopoietische cellen), die een complexe structuur vormen om normale hematopoiese te garanderen8 . De biologische functies van de hematopoëtische niche omvatten regulatie van HSC-overleving, adhesie, rust, homing en differentiatie door middel van verschillende mechanismen (cel-cel- en cel-matrixinteracties, productie van oplosbare factoren, hypoxie) als reactie op meerdere fysiologische of niet-fysiologische stress 3,6. Hoewel deze hematopoietische niches aanvankelijk werden gezien als homogene entiteiten, hebben technologische ontwikkelingen zoals eencellige en beeldvormingsanalyses geleidelijk hun complexiteit, dynamiek en adaptieve eigenschappen onthuld 9,10,11.
De cruciale noodzaak om het gebruik van dieren voor het ontcijferen van menselijke fysiologische en pathologische processen te vervangen en te verminderen, leidt tot nieuwe kansen en uitdagingen11,12. Onder nieuw beschreven in vitro tools zijn driedimensionale (3D) modellen voorgesteld die de in vivo menselijke BM beter nabootsen dan klassieke tweedimensionale (2D) culturen 13,14,15,16,17. 3D-modellering lijkt dus een veelbelovende benadering om cel-cel- en cel-matrixinteracties te observeren, dichter bij die welke in vivo plaatsvinden. Met behulp van verschillende van deze modellen hebben sommige teams de overleving en proliferatie van HSC’s18,19 aangetoond. Er zijn verschillende 3D-modellen beschikbaar, de meest gebruikelijke aanpak is het gebruik van op steigers gebaseerde 3D-biomaterialen zoals hydrogels, colloïden of collageen, geassocieerd met MSC’s die profiteren van hun osteoblastische afstammingsdifferentiatiecapaciteiten 20,21,22. Niettemin is er geen wereldwijde toestemming bereikt om te voldoen aan alle vereisten voor studies op menselijke cellen op een gebruiksvriendelijke en gestandaardiseerde manier23, vooral omdat deze huidige 3D-systemen voornamelijk afhankelijk zijn van primaire stromale cellen en dus lijden aan beperkte toegang tot primaire monsters, weefselbeschikbaarheid en heterogeniteit.
Bovendien moet het endotheelcelcompartiment worden geïntroduceerd, omdat deze cellen een belangrijk onderdeel vormen van cel-celinteracties en betrokken zijn bij het lot van stamcellen en de ontwikkeling van BM-ziekten, zowel bij leukemie24 als bij metastase25. We hebben eerder gemeld dat de toevoeging van pathologische elementen in een gestandaardiseerd humaan 3D-beenmergmodel kenmerken recapituuleert die zijn waargenomen in patiëntmonsters, zoals extracellulaire matrix (ECM) -veranderingen26. Om de dynamiek en interacties tussen de menselijke BM-micro-omgeving en de residente cellen beter te begrijpen, bieden we een gedetailleerd protocol voor een gebruiksvriendelijk en gestandaardiseerd systeem om een minimale, goed georganiseerde, BM-achtige structuur te bouwen. Dit systeem bestaat uit drie menselijke beenmergceltypen- endotheelcellen en stromale cellen, die de micro-omgeving vertegenwoordigen, en HSC’s. Door specifieke kralen te gebruiken als een steiger en een osteoblastisch differentiatiemedium, zal de verkregen 3D-structuur de menselijke medullaire niche nabootsen, waardoor een handige studie van menselijk beenmerg mogelijk is.
Een van de huidige uitdagingen waarmee studies over menselijke fysiologische en bijbehorende pathologische problemen worden geconfronteerd, is het gebrek aan modellen die de complexe functies van menselijke organen nauwkeurig nabootsen. In het geval van menselijke BM 3D-modellen gebruiken veel modellen hydrogels en reproduceren ze gedeeltelijk de BM, wat de kracht van 3D-cultuurcondities illustreert in vergelijking met klassieke 2D-culturen om bijvoorbeeld een betere osteoblastische differentiatiete garanderen 27,28. Ondanks de goede reproduceerbaarheid en het gebruiksgemak bootsen deze systemen echter niet de menselijke BM 3D-structuur en -architectuur na, wat een aanzienlijke invloed kan hebben op verdere analyses. Technologische vooruitgang heeft wetenschappers in staat gesteld om de inheemse menselijke osteoblastische niche-omgeving beter te reproduceren met behulp van een op perfusie gebaseerd bioreactorsysteem om sommige HSC-eigenschappen te behouden29. De ontwikkeling van microfluïdische apparaten heeft geleid tot nieuwe benaderingen om een relevante beenmergachtige structuur te reproduceren, maar hebben tot nu toe slechts beperkte kenmerken van het beenmerg bereikt en hebben daarom toepassingen beperkt 30,31,32,33.
Vooruitgang in de materiaalwetenschappen heeft bijgedragen aan de ontwikkeling van een breed scala aan natuurlijke of synthetische biomaterialen, die kunnen worden gebruikt om relevante 3D-botkweeksystemen te ontwikkelen. Dergelijke systemen zijn echter soms moeilijk te ontwikkelen in standaard biologische laboratoria zonder interne vaardigheden in de biofysica. Bovendien bereiken deze systemen in de meeste gevallen een beperkt vermogen om de 3D-structuur van het menselijk bot na te bootsen, inclusief de BM-micro-omgeving, en hebben ze grote hoeveelheden cytokines en groeifactoren gebruikt, waardoor een kunstmatig rijk kweekmedium is ontstaan34.
De keuze om osteoblastische differentiatie te induceren in plaats van adipocytische differentiatie was gebaseerd op het feit dat preosteoblasten en osteoblasten zijn beschreven als onderdeel van de endosteale niche35. Dit identificeerde osteoblastische cellen als gevraagde componenten van zowel bot als beenmerg. Onder de cellulaire componenten van het beenmerg bezetten endotheel- en stromale cellen een groot deel van de micro-omgeving. Bovendien produceren deze twee celtypen structurele niet-cellulaire componenten van de extracellulaire matrix en cytokines die betrokken zijn bij de regulatie van homeostase en differentiatie, hier gevraagd om een verkalkte structuur te genereren. Dit rechtvaardigt dus het gebruik van endotheel- en stromale cellen en onze keuze van cellijnen om gemakkelijke toegang mogelijk te maken en de reproduceerbaarheid tussen laboratoria te vergroten. Omdat de cultuur van de HMEC-1-lijn in de loop van de tijd stabieler werd, werd deze cellijn behouden voor de ontwikkeling van het 3D-systeem. Voor stromale cellen vergeleken we in 2D-cultuur de osteoblastdifferentiatiecapaciteit van de stromale cellijnen afgeleid van normaal beenmerg: HS5 en HS27A. We ontdekten dat de HS5-lijn niet zoveel onderscheid maakte als de HS27A-lijn in het 3D-systeem dat met een van beide cellijnen werd gegenereerd. In dit opzicht hebben pogingen om HS27A-cellen te vervangen door de HS5-lijn geresulteerd in de productie van een minder rigide structuur, wat suggereert dat HS27A meer geschikt is.
Zowel HS27A- als HMEC-1-cellijnen werden gekweekt in verschillende mediacombinaties, waarbij men de beste rigide structuur en uitlijningen van HMEC-1 langs osteoblaststructuren uitlokt, zodat de productie van de extracellulaire matrix een relatieve stijfheid aan de basisstructuur toevoegt. Analyse van de vooruitgang van differentiatie bij D14 toonde aan dat de differentiatie geavanceerder was bij D21 (meting van BSP, late osteoblastische marker), met een verhouding 1:2 voor HMEC-1:HS27A en met betere resultaten wanneer 2 × 106 HS27A werden geïntroduceerd. Endotheelcellen hebben ook een belangrijke rol bij het reguleren van homeostase en differentiatie (onder andere door de toevoer van cytokines). Het feit dat HMEC-1-cellen in dit systeem worden onderhouden, geeft aan dat ze op zijn minst deze rol kunnen vervullen, en dit draagt bij aan de legitimiteit van ons model. Voor de HMEC-1 endotheellijn was het belangrijk om deze vroeg genoeg te introduceren, zodat deze goed in de structuur kon worden geïntegreerd en in de hoop dat deze cellen uitlijningen of zelfs buizen in de structuur konden vormen. Co-kweektests van HS27A en HMEC-1 werden uitgevoerd door de laatste in verschillende stadia te introduceren: D0, D7, D14; er werd geen opmerkelijk verschil waargenomen, noch in de differentiatie van de stromale cellen, noch in het onderhoud of de positionering van de endotheelcellen. Deze cellen werden dus aan het begin van het proces geïntroduceerd. Hematopoietische cellen werden geïntroduceerd in een tijd waarin osteoblastische differentiatie geavanceerd genoeg zou zijn om cel-celinteracties te bevorderen. Deze keuze werd ook bepaald door het feit dat deze osteoblastische differentiatie wordt geconditioneerd door het gebruik van een medium, dat volgens onze tests het onderhoud van de hematopoëtische cellen niet volledig ondersteunt. Hematologische cellen kunnen cellijnen of primaire BM CD45 hematopoietische cellen zijn.
Vanuit dit 3D-model zouden we kunnen overwegen om elk celtype te vervangen door primaire cellen, normaal of pathologisch, of zelfs om andere celtypen toe te voegen om biomimetische eigenschappen te stimuleren, zoals immuuncellen, adipocyten of fibroblasten26. In feite is de HS27A-cellijn vervangen door primaire BM MSC’s met een lage passaging. Evenzo werden hematologische cellijnen vervangen door primaire BM-hematopoietische cellen. De vervanging van HMEC-1-cellen door primaire endotheelcellen is echter nog niet getest. Momenteel kan dit model nog steeds worden verbeterd in termen van vasculatuurrepresentatie, omdat hoewel endotheelcellen aanwezig zijn en correct interageren met andere cellen uit de micro-omgeving (bijv. Hematopoietische cellen), ze geen gestructureerde bloedvaten vormen, waardoor flowperfusie wordt uitgesloten om functionele bloedvaten na te bootsen. Over het algemeen zou dit de complexiteit en representativiteit van het huidige minimale 3D-model geleidelijk kunnen vergroten. De toevoeging van andere celtypen kan studies vergemakkelijken die andere kwesties onderzoeken, zoals het belang van lokale BM-ontsteking of resistentie tegen immunotherapie.
Dit 3D-systeem heeft echter 3 weken nodig voordat cellen van belang, hematologische cellen of epitheelkankercellen als het metastaseproces wordt geëvalueerd, kunnen worden toegevoegd. Steriele omstandigheden moeten worden gehandhaafd, omdat gemiddelde veranderingen tweemaal per week soms kunnen leiden tot gemiddelde besmetting. Verder, aangezien sommige cellen door de poriën van de insert kunnen migreren en in de put beginnen te verspreiden, wat leidt tot een verhoogd mediumverbruik, wordt regelmatige controle aanbevolen.
We beschreven hier een 3D-steiger die osteoblastische differentiatie mogelijk maakt en ontwikkelden een relevante , in vitro, 3D, menselijke BM-achtige micro-omgeving. Dit systeem maakt in situ analyse en het uiteindelijke ophalen van levende cellen mogelijk. Dit systeem biedt een nieuwe en zeer flexibele tool, reproduceerbaar en gebruiksvriendelijk, met een breed scala aan toepassingen om interacties en mechanismen binnen de menselijke BM-micro-omgeving te bestuderen.
The authors have nothing to disclose.
We danken P. Battiston-Montagne en A. Jambon van het CRCL cytometrie platform en N. Gadot en C. Leneve van het Research Pathology Platform, Department of Translational Research and Innovation, Centre Léon Bérard. De auteurs zijn B. Manship dankbaar voor de Engelse editie. Dit werk werd gefinancierd door Inserm en FI-LMC aan V. M. S., en S. L. K. A. en L. B. werden ondersteund door een subsidie van Société Française d’Hématologie.
3,3-Diaminobenzidine (DAB) Liquid Substrate System | MERCK SIGMA | D7304 | IHC staining |
5 mL Pipette | SARSTEDT | 861253001 | Medium change |
Anti Mouse HRP | Thermofisher | 62-6520 | IHC secondary staining |
Anti Rabbit HRP | Thermofisher | 31460 | IHC secondary staining |
Ascorbic Acid 250 μM | MERCK SIGMA | A92902 | ODM medium |
BCP | CaP Biomaterials LLC-US |
3D Beads | |
Beta Glycerophosphate 10 mM | MERCK SIGMA | G9422 | ODM medium |
CD31-BV711 | BD | 744078 | 3D endothelial Cell population labelling |
CD34-APC | BD | 555824 | 3D immature hematological Cell population labelling |
CD38-PE-Cy5 | BD | 555461 | 3D progenitor hematological Cell population labelling |
CD45 | Miltenyibiotec | 130-110-637 | IHC staining of hematological cells |
CD45-APC | BD | 555485 | 3D hematological Cell population labelling |
CD45-BV500 | BD | 560777 | 3D hematological Cell population labelling |
CD73 | Miltenyibiotec | 130-120-066 | IHC staining of stromal compartment |
CD73-BV605 | BD | 563199 | 3D osteoblastic Cell population labelling |
Cell Strainer for FACS equipment with 5 mL tube | FALCON | 352235 | Strainer and tube used to collect the cells and eliminate beads |
Collagenase | MERCK SIGMA | C2674-1G | 3D enzymatic dissociation |
Cytometry filtration tube | Thermofisher | 10585801 | 3D retrieved cells filtration |
Cytometry tube | Thermofisher | 10100151 | 3D retrieved cells labelling |
DAPI (Solution 12) | Chemometec | 910-3012 | 3D retrieved viable cells labelling |
Dexamethasone | Thermofisher | A13449 | ODM medium |
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate 500 mL | Thermofisher | 31966021 | ODM medium |
EGF | MERCK SIGMA | E9644-0.2MG | HMED-1 medium |
Eppendorf 1.5 mL tube | SARSTEDT | 72696 | For beads autoclave and supernatant retieve |
Falcon 15 mL | FALCON | 352096 | For 3D Dissociation |
FBS | DUTSCHER | S1900-500 | To supplement culturing medium and stop trypsin action |
Glutamax | Thermofisher | A1286001 | glutamine substitute for HMED-1 medium |
Hematoxylin Solution, Gill No. 1 | MERCK SIGMA | GHS132-1L | IHC staining |
HMEC-1 | ATCC | CRL-3243 | 3D endothelial Cell population |
HS27A | ATCC | CRL-2496 | 3D osteoblastic Cell population |
Hydrocortisone | MERCK SIGMA | H0135-1MG | HMED-1 medium |
Insert: Nunc Polycarbonate Cell Culture Inserts in Multi-Well Plates | THERMO SCIENTIFIC NUNC | 140627 | To harvest cells and form a 3D Bone like structure |
KI-67 IHC | Thermofisher | MA5-14520 | IHC staining of proliferative cells |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Thermofisher | 10372019 | HMED-1 medium |
Micropipette (1,000 µL) | Eppendorf | 4924000088 | Medium change |
PBS D 1x | Thermofisher | 14190169 | Cells/ Insert wash |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermofisher | 15140122 | To supplement culturing medium |
PFA (Formaldehyde 16%) | EUROMEDEX | EM-15710 | 3D Fixation (dilution with PBS 1X) |
RMPI 1640 medium, glutamax supplement | Thermofisher | 61870044 | Cuture medium |
Scalpel | FISHER SCIENTIFIC | 11768353 | 3D membrane cutting |
Six well plate | FALCON | 353046 | 3D culture |
TRYPSIN-EDTA SOLUTION (1x) | Thermofisher | 25300096 | 3D enzymatic dissociation |