Adoptiv overførsel af IL-33-stimulerede makrofager til bleomycin-inducerede musemodeller for at studere deres virkning på idiopatisk lungefibrose in vivo

Summary

Denne protokol beskriver isoleringen af pulmonale interstitielle makrofager (IM’er) og deres adoptive overførsel efter IL-33-stimulering af lungealveolerne i en musemodel, hvilket kan lette in vivo-undersøgelsen af idiopatisk lungefibrose (IPF).

Abstract

Det inflammatoriske respons forårsaget af tidlig lungeskade er en af de vigtige årsager til udviklingen af idiopatisk lungefibrose (IPF), som ledsages af aktivering af inflammatoriske celler såsom makrofager og neutrofiler samt frigivelse af inflammatoriske faktorer, herunder TNF-α, IL-1β og IL-6. Tidlig inflammation forårsaget af aktiverede pulmonale interstitielle makrofager (IM’er) som reaktion på IL-33-stimulering er kendt for at spille en afgørende rolle i den patologiske proces af IPF. Denne protokol beskriver den adoptive overførsel af IM’er stimuleret af IL-33 til lungerne hos mus for at studere IPF-udvikling. Det involverer isolering og dyrkning af primære IM’er fra værtsmuselunger, efterfulgt af adoptiv overførsel af stimulerede IM’er til alveolerne hos bleomycin (BLM)-inducerede IPF-modtagermus (som tidligere er blevet udtømt for alveolære makrofager ved behandling med clodronatliposomer) og patologisk evaluering af disse mus. De repræsentative resultater viser, at adoptiv overførsel af IL-33-stimulerede makrofager forværrer lungefibrose hos mus, hvilket tyder på, at etableringen af makrofagadoptivoverførselseksperimentet er et godt teknisk middel til at studere IPF-patologi.

Introduction

Idiopatisk lungefibrose (IPF) er en diffus lungeinflammatorisk sygdom forårsaget af mange faktorer¹. I cytokinmikromiljøet af Th1- og Th2-immunresponset kan makrofager polariseres til klassisk aktiverede makrofager (M1) og alternativt aktiverede makrofager (M2). Lipopolysaccharider (LPS) eller cytokinet IFN- γ inducerer M1-makrofager til at polarisere og producere proinflammatoriske cytokiner, herunder iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α og IL-12. I modsætning hertil driver type II-cytokinerne IL-4 og IL-13 polariseringen af M2-makrofager, som kan producere forskellige fibroblastvækstfremmende faktorer, såsom TGF-β og PDGF, der fremmer lungefibrose². Den patologiske proces af IPF ledsages af makrofagaktivering og infiltration. IPF formidler skadereparation, inflammation og fibrose gennem frigivelse af cytokiner³. Da der kun er begrænsede behandlingsmuligheder til rådighed, har udforskning af IPF’s molekylærpatologiske mekanismer stor betydning for udviklingen af nye strategier for IPF-forebyggelse og -behandling. Tidligere undersøgelser foretaget af vores gruppe og andre forskere ^4,5 har bekræftet den øgede frigivelse af IL-33 hos IPF-patienter og i musemodeller med bleomycin (BLM)-induceret IPF. IL-33 frigives af epitel- og endotelcellerne under fibrose og er involveret i makrofagaktivering, hvilket resulterer i unormal proliferation af fibroblaster, leukocytinfiltration og eventuelt tab af lungefunktion⁵. Den nuværende protokol beskriver den adoptive overførsel af IL-33-stimulerede interstitielle makrofager (IM’er) til alveolerne som et middel til at studere IPF-udvikling i musemodeller. Her blev IM’er isoleret fra lungevævet hos værtsmus, dyrket in vitro, stimuleret med IL-33 i 24 timer og derefter adoptivt overført til alveolerne hos modtagermus ved trakealinjektion. Den direkte indsamling af stimulerede musemakrofager og deres adoptive overførsel til modtageralveolerne viste sig at forværre graden af lungefibrose og kan tydeligere illustrere stimulerende faktorers indflydelse på fibrose sammenlignet med de tidligere undersøgelser⁶. Teknikken beskrevet i denne artikel kan gøre det muligt for forskere at udforske funktionen af makrofager stimuleret af potentielle cytokiner i udviklingen af IPF.

Protocol

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen for pasning og brug af forsøgsdyr. Alle dyreforsøg blev godkendt af den eksperimentelle etiske komité for dyrevelfærd ved Jiangnan University (JN nr. 20211130m1720615[501]). BEMÆRK: I alt blev 10 C57BL/6-hanmus i alderen 6-8 uger gamle og med en vægt på 20-25 g anvendt i dette studie. De tre eksperimentelle grupper i undersøgelsen omfattede tre modtagermus hver, og en værtsmus blev brugt til IM-isolering. <p …

Representative Results

Den protokol, der anvendes her, er opsummeret i rutediagrammet i figur 1. Indånding af clodronatliposomer gennem næsen (figur 2) blev brugt til at nedbryde lungemakrofagerne hos voksne C57BL/6-mus, og dette gav en god modtagermusemodel. Pulmonale IM’er blev isoleret fra en anden ubehandlet (værts)mus (figur 3A,B) og dyrket in vitro. De isolerede makrofager blev stimuleret med IL-33 i 24 timer og derefte…

Discussion

Denne undersøgelse giver en effektiv metode til at nedbryde, isolere, dyrke og overføre makrofager, hvilket kan hjælpe med at studere mekanismerne for lungefibrose hos mus. Der er mange metoder til udtømning af musemakrofager, såsom trakeal administration, haleveneinjektion og nasal indånding¹¹. Denne undersøgelse optimerede den nasale inhalationsmetode, som er enkel at betjene og effektivt kan nedbryde lungemakrofager ^8,9. Efter IL…

Materials

DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterial indwelling needle	B Braun Melsingen AG,Germany	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson,USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Carbon dioxide incubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems,USA	1124F
CD11c	R&D Systems,USA	N418
Cell culture dish	Thermo Forma, USA	174926
Clodronate liposomes	Clodronate liposomes,Netherlands	CI-150-150
Collagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R&D Systems,USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton,Dickinson and Company, USA	352340
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies,USA	1047571
Hematoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology,China	06-570
LightCycler 480 PCR detection system	Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon microscope	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, streptomycin	Life technologies,USA	877113
Phosphate buffer (PBS)	Guangdong Huankai Microbial Technology ,China	1535882
RBC lysis buffer	Beyotime Biotechnology Company,China	C3702
RNA Isolater	Vazyme company,China	R401-01-AA	Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine	Shenzhen Rayward Life Technology ,China	R500
Semi-automatic paraffin slicer	Leica, Germany	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0.25%	Life Technologies, USA	1627172