Transfert adoptif de macrophages stimulés par l’IL-33 dans des modèles murins induits par la bléomycine pour étudier leur effet sur la fibrose pulmonaire idiopathique in vivo

Summary

Ce protocole décrit l’isolement des macrophages interstitiels pulmonaires (IM) et leur transfert adoptif après stimulation IL-33 des alvéoles pulmonaires dans un modèle murin, ce qui peut faciliter l’étude in vivo de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI).

Abstract

La réponse inflammatoire causée par une lésion pulmonaire précoce est l’une des causes importantes du développement de la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI), qui s’accompagne de l’activation de cellules inflammatoires telles que les macrophages et les neutrophiles, ainsi que de la libération de facteurs inflammatoires, notamment le TNF-α, l’IL-1β et l’IL-6. L’inflammation précoce causée par des macrophages interstitiels pulmonaires (IM) activés en réponse à la stimulation de l’IL-33 est connue pour jouer un rôle essentiel dans le processus pathologique de la FPI. Ce protocole décrit le transfert adoptif des IM stimulées par l’IL-33 dans les poumons de souris pour étudier le développement de la FPI. Il implique l’isolement et la culture de MI primaires à partir des poumons de souris hôtes, suivis du transfert adoptif de MI stimulés dans les alvéoles de souris receveuses de FPI induites par la bléomycine (BLM) (qui ont été précédemment appauvries en macrophages alvéolaires par un traitement avec des liposomes clodronates), et l’évaluation pathologique de ces souris. Les résultats représentatifs montrent que le transfert adoptif de macrophages stimulés par l’IL-33 aggrave la fibrose pulmonaire chez la souris, suggérant que la mise en place de l’expérience de transfert adoptif de macrophages est un bon moyen technique d’étudier la pathologie de la FPI.

Introduction

La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est une maladie inflammatoire pulmonaire diffuse causée par de nombreux facteurs¹. Dans le microenvironnement des cytokines de la réponse immunitaire Th1 et Th2, les macrophages peuvent être polarisés en macrophages classiquement activés (M1) et en macrophages activés (M2). Les lipopolysaccharides (LPS) ou la cytokine IFN-γ induisent les macrophages M1 à polariser et à produire des cytokines pro-inflammatoires, notamment iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α et IL-12. En revanche, les cytokines de type II IL-4 et IL-13 entraînent la polarisation des macrophages M2, qui peuvent produire différents facteurs favorisant la croissance des fibroblastes, tels que le TGF-β et le PDGF, qui favorisent la fibrose pulmonaire². Le processus pathologique de la FPI s’accompagne d’une activation et d’une infiltration des macrophages. La FPI intervient dans la réparation des blessures, l’inflammation et la fibrose par la libération de cytokines³. Comme seules des options thérapeutiques limitées sont disponibles, l’exploration des mécanismes pathologiques moléculaires de la FPI revêt une grande importance pour le développement de nouvelles stratégies de prévention et de traitement de la FPI. Des études antérieures menées par notre groupe et d’autres chercheurs ^4,5 ont confirmé la libération accrue d’IL-33 chez les patients atteints de FPI et dans des modèles murins atteints de FPI induite par la bléomycine (BLM). L’IL-33 est libérée par les cellules épithéliales et endothéliales lors de la fibrose et est impliquée dans l’activation des macrophages, entraînant la prolifération anormale des fibroblastes, l’infiltration des leucocytes et la perte éventuelle de la fonction pulmonaire⁵. Le protocole actuel décrit le transfert adoptif de macrophages interstitiels (IM) stimulés par l’IL-33 dans les alvéoles comme moyen d’étudier le développement de la FPI dans des modèles murins. Ici, les IM ont été isolés du tissu pulmonaire de souris hôtes, cultivés in vitro, stimulés avec de l’IL-33 pendant 24 h, puis transférés adoptivement dans les alvéoles de souris receveuses par injection trachéale. La collecte directe de macrophages de souris stimulés et leur transfert adoptif dans les alvéoles receveuses se sont avérés aggraver le degré de fibrose pulmonaire et peuvent illustrer plus clairement l’influence des facteurs stimulants sur la fibrose par rapport aux études précédentes⁶. La technique décrite dans cet article peut permettre aux chercheurs d’explorer la fonction des macrophages stimulés par des cytokines potentielles dans le développement de la FPI.

Protocol

Toutes les expériences ont été réalisées conformément au Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le comité d’éthique du bien-être animal expérimental de l’Université de Jiangnan (JN n n ° 20211130m1720615 [501]). NOTE: Au total, 10 souris mâles C57BL / 6 âgées de 6 à 8 semaines et pesant 20 à 25 g ont été utilisées dans cette étude. Les trois groupes expérimentaux de…

Representative Results

Le protocole utilisé ici est résumé dans l’organigramme de la figure 1. L’inhalation de liposomes de clodronate par le nez (Figure 2) a été utilisée pour épuiser les macrophages pulmonaires de souris adultes C57BL/6, ce qui a produit un bon modèle de souris receveuse. Les MI pulmonaires ont été isolées chez une autre souris (hôte) non traitée (figure 3A,B) et cultivées in vitro. Les macro…

Discussion

Cette étude fournit une méthode efficace pour épuiser, isoler, cultiver et transférer les macrophages, ce qui peut aider à étudier les mécanismes de la fibrose pulmonaire chez la souris. Il existe de nombreuses méthodes pour la déplétion des macrophages de souris, telles que l’administration trachéale, l’injection de veines de la queue et l’inhalation nasale¹¹. Cette étude a optimisé la méthode d’inhalation nasale, simple à utiliser et capable d’épuiser efficacement les m…

Materials

DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterial indwelling needle	B Braun Melsingen AG,Germany	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson,USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Carbon dioxide incubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems,USA	1124F
CD11c	R&D Systems,USA	N418
Cell culture dish	Thermo Forma, USA	174926
Clodronate liposomes	Clodronate liposomes,Netherlands	CI-150-150
Collagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R&D Systems,USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton,Dickinson and Company, USA	352340
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies,USA	1047571
Hematoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology,China	06-570
LightCycler 480 PCR detection system	Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon microscope	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, streptomycin	Life technologies,USA	877113
Phosphate buffer (PBS)	Guangdong Huankai Microbial Technology ,China	1535882
RBC lysis buffer	Beyotime Biotechnology Company,China	C3702
RNA Isolater	Vazyme company,China	R401-01-AA	Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine	Shenzhen Rayward Life Technology ,China	R500
Semi-automatic paraffin slicer	Leica, Germany	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0.25%	Life Technologies, USA	1627172