Adoptiv overføring av IL-33-stimulerte makrofager i bleomycininduserte musemodeller for å studere deres effekt på idiopatisk lungefibrose in vivo

Summary

Denne protokollen beskriver isolering av pulmonale interstitielle makrofager (IM) og deres adoptivoverføring etter IL-33-stimulering av lungealveolene i en musemodell, noe som kan lette in vivo-studien av idiopatisk lungefibrose (IPF).

Abstract

Den inflammatoriske responsen forårsaket av tidlig lungeskade er en av de viktigste årsakene til utviklingen av idiopatisk lungefibrose (IPF), som ledsages av aktivering av inflammatoriske celler som makrofager og nøytrofiler, samt frigjøring av inflammatoriske faktorer, inkludert TNF-α, IL-1β og IL-6. Tidlig inflammasjon forårsaket av aktiverte pulmonale interstitielle makrofager (IM) som respons på IL-33-stimulering er kjent for å spille en viktig rolle i den patologiske prosessen med IPF. Denne protokollen beskriver adoptivoverføring av IM stimulert av IL-33 til lungene hos mus for å studere IPF-utvikling. Det involverer isolering og kultur av primære IM fra vertsmuslungene, etterfulgt av adoptivoverføring av stimulerte IM til alveolene hos bleomycin (BLM)-induserte IPF-mottakermus (som tidligere har blitt utarmet av alveolære makrofager ved behandling med clodronatliposomer), og den patologiske evalueringen av disse musene. De representative resultatene viser at adoptivoverføring av IL-33-stimulerte makrofager forverrer lungefibrose hos mus, noe som tyder på at etableringen av makrofag-adoptivoverføringseksperimentet er et godt teknisk middel for å studere IPF-patologi.

Introduction

Idiopatisk lungefibrose (IPF) er en diffus lungebetennelsessykdom forårsaket av mange faktorer¹. I cytokinmikromiljøet til Th1- og Th2-immunresponsen kan makrofager polariseres til klassisk aktiverte makrofager (M1) og alternativt aktiverte makrofager (M2). Lipopolysakkarider (LPS) eller cytokinet IFN- γ induserer M1-makrofager til å polarisere og produsere proinflammatoriske cytokiner, inkludert iNOS, IL-1, IL-6, TNF-α og IL-12. I motsetning til dette driver type II-cytokinene IL-4 og IL-13 polariseringen av M2-makrofager, som kan produsere forskjellige fibroblastvekstfremmende faktorer, som TGF-β og PDGF, som fremmer lungefibrose². Den patologiske prosessen med IPF ledsages av makrofagaktivering og infiltrasjon. IPF medierer skadereparasjon, betennelse og fibrose gjennom frigjøring av cytokiner³. Siden bare begrensede terapeutiske alternativer er tilgjengelige, har det å utforske de molekylærpatologiske mekanismene ved IPF stor betydning for å utvikle nye strategier for forebygging og behandling av IPF. Tidligere studier av vår gruppe og andre forskere ^4,5 har bekreftet økt frisetting av IL-33 hos IPF-pasienter og i musemodeller med bleomycin (BLM)-indusert IPF. IL-33 frigjøres av epitel- og endotelceller under fibrose og er involvert i makrofagaktivering, noe som resulterer i unormal spredning av fibroblaster, leukocyttinfiltrasjon og eventuelt tap av lungefunksjon⁵. Den nåværende protokollen beskriver adoptivoverføring av IL-33-stimulerte interstitielle makrofager (IM) inn i alveolene som et middel til å studere IPF-utvikling i musemodeller. Her ble IM isolert fra lungevevet til vertsmus, dyrket in vitro, stimulert med IL-33 i 24 timer, og deretter adoptivt overført til alveolene hos mottakermus ved trakealinjeksjon. Den direkte samlingen av stimulerte musemakrofager og deres adoptivoverføring til mottakeralveolene ble funnet å forverre graden av lungefibrose og kan tydeligere illustrere påvirkningen av stimulerende faktorer på fibrose sammenlignet med tidligere studier⁶. Teknikken som beskrives i denne artikkelen, kan gjøre det mulig for forskere å undersøke funksjonen til makrofager stimulert av potensielle cytokiner i utviklingen av IPF.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i henhold til veiledningen for stell og bruk av forsøksdyr. Alle dyreforsøkene ble godkjent av Experimental Animal Welfare Ethics Committee ved Jiangnan University (JN nr. 20211130m1720615[501]). MERK: Totalt ble 10 mannlige C57BL/6 mus i alderen 6-8 uker gamle og veier 20-25 g brukt i denne studien. De tre eksperimentelle gruppene i studien inkluderte tre mottakermus hver, og en vertsmus ble brukt til IM-isolasjonen. 1…

Representative Results

Protokollen som brukes her er oppsummert i flytskjemaet i figur 1. Inhalasjon av klodronatliposomer gjennom nesen (figur 2) ble brukt til å tømme lungemakrofagene hos voksne C57BL/6-mus, og dette ga en god mottakermusemodell. Pulmonale direktemeldinger ble isolert fra en annen ubehandlet mus (vertsmus) (figur 3A, B) og dyrket in vitro. De isolerte makrofagene ble stimulert med IL-33 i 24 timer og derette…

Discussion

Denne studien gir en effektiv metode for å tømme, isolere, kultur og overføre makrofager, noe som kan bidra til å studere mekanismene for lungefibrose hos mus. Det er mange metoder for uttømming av makrofager fra mus, for eksempel trakealadministrasjon, injeksjon av halevene og nasal innånding¹¹. Denne studien optimaliserte nasal innåndingsmetoden, som er enkel å betjene og effektivt kan tømme lungemakrofager ^8,9. Etter IL-33-stim…

Materials

DMEM	Life technologies Biotechnology,USA	1508012
Arterial indwelling needle	B Braun Melsingen AG,Germany	21G15G8393
BD Accuri C6 Plus	Becton Dickinson,USA
Bleomycin	Biotang, USA	Ab9465
Carbon dioxide incubator	Thermo Forma, USA	Thermo Forma370
CD11b	R&D Systems,USA	1124F
CD11c	R&D Systems,USA	N418
Cell culture dish	Thermo Forma, USA	174926
Clodronate liposomes	Clodronate liposomes,Netherlands	CI-150-150
Collagenase A	Sigma-Aldrich, USA	10103578001
F4/80	R&D Systems,USA	521204
Falcon Cell Strainer	Becton,Dickinson and Company, USA	352340
Fetal bovine serum (FBS)	Life technologies,USA	1047571
Hematoxylin Eosin	Nanjing Jiancheng Technology,China	06-570
LightCycler 480 PCR detection system	Roche, USA
Murine recombinant factor IL-33	Peprotech, USA	210-33
Nikon microscope	Nikon Corporation, Japan	941185
Penicillin, streptomycin	Life technologies,USA	877113
Phosphate buffer (PBS)	Guangdong Huankai Microbial Technology ,China	1535882
RBC lysis buffer	Beyotime Biotechnology Company,China	C3702
RNA Isolater	Vazyme company,China	R401-01-AA	Total RNA extraction reagent
RWD Inhalation Anesthesia Machine	Shenzhen Rayward Life Technology ,China	R500
Semi-automatic paraffin slicer	Leica, Germany	LeicaRM2245
SYBR Premix Ex Taq	Takara, Japan	410800
Trypsin 0.25%	Life Technologies, USA	1627172