Denne protokol beskriver to metoder til måling af caspaseaktivitet gennem et fluorogent substrat ved hjælp af flowcytometri eller et spektrofluorometer.
Aktiveringen af cysteinproteaser, kendt som caspaser, forbliver en vigtig proces i flere former for celledød. Caspaser er kritiske initiatorer og bødler af apoptose, den mest studerede form for programmeret celledød. Apoptose opstår under udviklingsprocesser og er en nødvendig begivenhed i vævshomeostase. Pyroptose er en anden form for celledød, der udnytter caspaser og er en kritisk proces i aktivering af immunsystemet gennem aktivering af inflammasomet, hvilket resulterer i frigivelse af medlemmer af interleukin-1 (IL-1) familien. For at vurdere caspaseaktivitet kan målsubstrater vurderes. Følsomhed kan dog være et problem, når man undersøger enkeltceller eller aktivitet på lavt niveau. Vi demonstrerer, hvordan et fluorogent substrat kan anvendes med et populationsbaseret assay eller enkeltcelleassay ved flowcytometri. Med korrekt kontrol kan forskellige aminosyresekvenser bruges til at identificere, hvilke caspaser der er aktive. Ved hjælp af disse assays er det samtidige tab af hæmmere af apoptoseproteiner ved tumornekrosefaktor (TNF) stimulering blevet identificeret, hvilket primært inducerer apoptose i makrofager snarere end andre former for celledød.
Caspaser er involveret i flere former for programmeret celledød. Apoptose er den mest studerede form for programmeret celledød og er forbundet med caspase aktivitet1. Alle caspaser har en stor og lille katalytisk underenhed. Caspase-1, caspase-4, caspase-5, caspase-9 og caspase-11 har et caspase aktiverings- og rekrutteringsdomæne (CARD), og caspase-8 og caspase-10 indeholder dødseffektordomæner (DED) 2,3,4,5 (tabel 1). Apoptose kan initieres af to hovedveje: den ydre vej og den indre vej. Den ekstrinsiske apoptotiske vej udløses af dødsreceptorer, som er en del af tumornekrosefaktorens superfamilie (TNFSF). Dødsreceptorer besidder DED-domæner, hvilket letter caspase-8-aktivitet6. Den iboende apoptotiske vej involverer aktivering af caspase-9 efter dannelsen af apoptosomet, hvilket kræver frigivelse af cytokrom c og Apaf-17. Aktiveringen af enten initiator caspase, caspase-8 eller caspase-9, fører til spaltning og efterfølgende aktivering af bødlekaspaserne, som er caspase-3, caspase-6 og caspase-7. At identificere, at bødlekaspaserne er aktive, indikerer, at cellerne gennemgår apoptose, og denne aktivering betragtes som en vigtig faktor i definitionen af celledødsmåden.
Caspase-aktivering er også et kritisk tidspunkt for regulering af inflammation og induktion af alternative former for programmeret celledød. For eksempel fører caspase-1-aktivering til modning af proinflammatoriske cytokiner af interleukin-1-familien8. Frigivelsen og aktiveringen af cytokiner fra denne familie, især IL-1β og IL-18, skyldes gasdermin D-spaltning og poredannelse ved plasmamembranen 9,10. Utilstrækkelig membranreparation af gasdermin D-porer kan resultere i en type celledød kendt som pyroptose11. Desuden resulterer caspase-8-aktivitet i hæmning af en caspase-uafhængig celledød kendt som necroptose12. Receptorinteragerende serin/threoninproteinkinase 1 (RIPK1) er en af de kritiske faktorer i nekrotose og i at drive inflammation reguleret af NF-kB. Modeller har vist, at RIPK1 spaltes af caspase-8, hvilket resulterer i begrænsning af NF-kB-signalering, apoptose og nekrotose13,14. Derfor kan identifikation af aktiviteten af forskellige caspaser hjælpe med at forstå den resulterende inflammation og celledødsmodalitet.
Uafhængigt af caspasernes funktion til regulering af celledødsmetoder kan caspaseaktivitet også regulere andre cytokinfamilier, såsom interferon (IFN), som reaktion på infektion15,16. Derudover er caspaser involveret i ikke-celledødsfunktioner, herunder beslutninger om celleskæbne, vævsreparation og regenerering, tumorigenese gennem DNA-reparation og neuronal synapsefunktion. Aktiviteten af caspaser i disse ikke-dødelige roller menes at være begrænset af cellulær lokalisering og mængden af caspaser. Derfor kan kvantificering af niveauet af caspaseaktivitet meget vel definere, om en celle gennemgår celledød, eller om caspase spiller en rolle i en ikke-celledødsfunktion 4,17,18.
Caspase aktivitet kan vurderes ved flere metoder. Western blotting for spaltede caspaser og deres substrater er blevet brugt som indikator for aktivitet, men disse analyser er i bedste fald kvalitative. For at afgøre, om caspaseaktivitet er forbundet med celledød, er en kvantitativ måling ideel. Da caspaser spalter substrater på et genkendelsessted bestående af fire aminosyrer, er kolorimetriske, luminescens eller fluorometriske metoder blevet udviklet. Imidlertid ser caspaser ud til at have plasticitet i deres substratgenkendelse19,20. Genkendelsessekvensen er ikke forbundet med proteindomænerne (tabel 1). Tetrapeptidsekvensen DEVD kan imidlertid bruges til at detektere caspase-3 og caspase-7 aktivitet20,21.
Smac-efterligning er forbindelser rettet mod hæmmere af apoptoseproteiner (IAP’er). Brugen af Smac-efterligning i en delmængde af kræftceller får cellerne til at blive følsomme over for TNF-induceret celledød22. I primære makrofager forårsager Smac-efterligning celledød uden eksogen tilsætning af TNF23,24. Tabet af cIAP1 ved Smac mimetisk induceret nedbrydning resulterer i produktion af TNF. Hvis der opdages caspaseaktivitet, betyder det, at cellerne ikke døde af necroptose, men på en apoptotisk måde. I denne metode anvendes påvisning af spaltet DEVD-substrat til at identificere caspase-3/caspase-7-aktivitet. Yderligere eksperimenter til bekræftelse af apoptotisk celledød er blevet offentliggjort tidligere24.
I denne metode anvendes et fluorogent substrat i et populationsbaseret assay eller enkeltcelleanalyse til måling af caspase-3/caspase-7-aktivitet. Begge metoder måler caspaseaktiviteten kvantitativt baseret på spaltningen af et substrat. En fordel er evnen til at udnytte disse metoder til adskillige prøver. Med disse metoder detekteres caspase-3/caspase-7-aktivitet i primære makrofager behandlet med Smac-mimetik.
Et kritisk aspekt af det populationsbaserede fluorometriske assay er tiden fra lysis til aflæsning af fluorescensen. Prøverne skal opbevares på is under hele proceduren, især inden analysen “aflæses”. Dette forhindrer for tidlig spaltning og fluorescens af substratet. Ved hjælp af det populationsbaserede assay kan der kræves mindre optimering. Mængden af protein, der anvendes i analysen, normaliseres, hvilket gør det muligt at sammenligne prøverne direkte. En advarsel er, at i et sent stadium af apoptotisk celledød reduceres den samlede proteinmængde; Derfor er påvisning af caspaseaktivitet muligvis ikke mulig. Forskellige kinetik eller forskellige behandlingsdoser anbefales for at omgå dette problem. Derudover kan anden software bruges til nøjagtigt at vurdere hastigheden af caspaseaktivitet udover den software, der er beskrevet i denne metode.
Til flowcytometrisk analyse kræves der nok begivenheder eller celler til at gates populationerne trygt. Derudover kan der kræves mere optimering i det flowbaserede assay for at opnå det optimale forhold mellem substrat og cellenummer. Med flowcytometri egner denne metode sig imidlertid til måling af yderligere parametre, såsom celleoverflademarkører til identifikation af celletype.
Både populations- og enkeltcellemetoderne kunne bruges til andre caspaser. Det er dog vigtigt at huske, at genkendelsessekvensen er mindre diskrimineret for andre caspaser. Som sådan skal andre metoder til caspaseaktivitet anvendes. Dette omfatter hæmning af caspaseaktivitet, CRISPR eller knock-down af specifikke caspaser og western blotting for at detektere spaltningen af kendte substrater.
En alternativ metode til påvisning af caspaseaktivitet er time-lapse imaging. Det samme permeable caspasesubstrat kunne anvendes sammen med andre levedygtighedsmarkører, såsom annexin V, til at give information om kinetikken ved celledød. Billeddannelse ville også adskille caspaseaktiviteten og celleoverlevelsen, hvilket muliggør påvisning af subletale mængder caspaseaktivitet i en cellepopulation. De ikke-dødelige funktioner af caspase-3/caspase-7 er forbundet med antiviral regulering i medfødte immunceller29, især aktiveringen af type I IFN via mitokondrie-DNA-frigivelse15,16. Disse analyser til måling af caspaseaktivitet er således kritiske for at identificere forskellige former for celledød og kan være nyttige til vurdering af ikke-celledødsfunktioner.
The authors have nothing to disclose.
W.W.W. støttes af Clöetta Medical Research Fellow-tilskud, S.R. støttes af CanDoc UZH Forschungskredit, og J.T. støttes af det kinesiske stipendieråd.
1.5 mL microfuge tubes | Sarstedt | 72.706.400 | |
15 cm Petri plates | Sarstedt | 82.1184.500 | |
37 degree incubator shaker | IKA shaker KS 4000i | 97014-816 | distributed by VWR |
6-well cell culture dish | Sarstedt | 83.392 | |
96 well flat bottom, white polystyrene, non-sterile | Sigma | CLS3600 | |
96 well flat plate | Sarstedt | 82.1581 | |
Ac-DEVD-AFC | Enzo Life Sciences | ALX-260-032-M005 | Caspase-3 substrate |
BD Fortessa | BD | any flow cytometer with the appropriate excitation and emission detector will work | |
b-glycerolphosphate | Sigma | G9422-10G | |
caspase-3 recombinant | Enzo Life Sciences | ALX-201-059-U025 | |
CHAPS | Sigma | 1.11662 | |
DMEM, low glucose, pyruvate | Thermoscientific | 31885023 | |
DMSO | Sigma | D8418-250ML | |
EDTA | Sigma | 03685-1KG | |
EGTA | Sigma | 324626-25GM | |
Etoposide | MedChem Express | HY-13629 | |
FBS | Thermoscientific | 26140 | |
Flow cytometry tubes | Falcon | 352008 | |
Flowjo | Flowjo | A license in required but any program that can analyze .fcs files will suffice | |
Glycerol | Sigma | G5516-500ML | |
HEPES | Sigma | H4034 | |
Magic Red caspase-3/7 assay kit; flow cytometry or imaging | Immunochemistry Technologies | 935 | |
M-CSF | ebioscience | 14-8983-80 | now a subsidiary of Thermoscientific |
M-Plex | Tecan | any fluorometric reader will work with the appropriate excitation and emission detectors | |
NaCl | Roth | 3957.1 | |
PBS pH 7.4 | Thermoscientific | 10010023 | |
Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100X) | Thermoscientific | 10378016 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 | protein concentration assay |
protease inhibitors | Biomol | P9070.100 | |
Smac mimetic, Compound A | Tetralogics | also known as 12911; structure shown in supplementary figures of Vince et al., Cell 2007 | |
Sodium Fluoride | Sigma | S7920-100G | |
sodium orthovanadate | Sigma | S6508-10G | |
sodium pyrophosphate | Sigma | P8010-500G | |
Staurosporine | MedChem Express | HY-15141 | |
sucrose | Sigma | 1.07687 | |
Tris Base | Sigma | T1503-1KG | |
Triton X100 | Sigma | T8787-50ML | |
TrypLE | Thermoscientific | A1285901 | In the protocol, it is listed as Trypsin |