हम मानव आंखों में रेटिना से रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) को कुशलतापूर्वक अलग करने और आरपीई के हिस्टोलॉजिकल और मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण के लिए पूरे आरपीई / कोरॉयड फ्लैटमाउंट उत्पन्न करने की एक विधि का वर्णन करते हैं।
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) और रेटिना कार्यात्मक और संरचनात्मक रूप से जुड़े ऊतक हैं जो प्रकाश धारणा और दृष्टि को विनियमित करने के लिए एक साथ काम करते हैं। आरपीई एपिकल सतह पर प्रोटीन फोटोरिसेप्टर बाहरी खंड की सतह पर प्रोटीन के साथ कसकर जुड़े होते हैं, जिससे आरपीई को फोटोरिसेप्टर / रेटिना से लगातार अलग करना मुश्किल हो जाता है। हमने फोटोरिसेप्टर और आरपीई कोशिकाओं के अलग-अलग सेलुलर विश्लेषण के लिए पूर्ण आरपीई / कोरॉयड और रेटिना फ्लैटमाउंट उत्पन्न करने के लिए मानव आंखों के आरपीई से रेटिना को कुशलतापूर्वक अलग करने के लिए एक विधि विकसित की। डी-मैनिटोल के उच्च-परासरण समाधान के एक इंट्राविट्रल इंजेक्शन, आरपीई द्वारा परिवहन नहीं की गई चीनी, ने आरपीई सेल जंक्शनों को नुकसान पहुंचाए बिना पूरे पीछे के कक्ष में आरपीई और रेटिना के पृथक्करण को प्रेरित किया। रेटिना से जुड़ा कोई आरपीई पैच नहीं देखा गया। एक्टिन के फेलोइडिन लेबलिंग ने आरपीई आकार संरक्षण दिखाया और पूरे उपकला के मोर्फोमेट्रिक विश्लेषण की अनुमति दी। आरपीई सेल सीमाओं को सटीक रूप से पहचानने और विभाजित करने और 30 विभिन्न आकार मैट्रिक्स को निर्धारित करने के लिए एक कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) आधारित सॉफ्टवेयर विकसित किया गया था। यह विच्छेदन विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इसे आसानी से अन्य पशु मॉडल तक बढ़ाया जा सकता है।
रेटिना वर्णक उपकला (आरपीई) और तंत्रिका रेटिना आरपीई पर फोटोरिसेप्टर की मजबूत शारीरिक निर्भरता के कारण एक दूसरे के साथ दृढ़ता से जुड़े हुए हैं। विच्छेदन के दौरान, आरपीई से तंत्रिका रेटिना का यांत्रिक पृथक्करण आरपीई कोशिकाओं के फटने का कारण बनता है, जिसमें आरपीई के एपिकल भाग रेटिना फोटोरिसेप्टर के बाहरी खंडों से जुड़े रहते हैं। आरपीई-रेटिना आसंजन की सीमा इतनी अधिक है कि अलगाव के बाद रेटिना पर शेष वर्णक की मात्रा का उपयोग रेटिना आसंजन1 की ताकत को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। विशेष रूप से, आरपीई तंग जंक्शन और एक्टिन संरचना जो उन्हें जोड़ती है, जो एपिकल साइड पर स्थित हैं, यांत्रिक पृथक्करण के दौरान टूट जाती हैं। इसलिए, सेल सीमाओं के लिए आरपीई फ्लैटमाउंट को धुंधला करने से एक पैची मोनोलेयर होता है जिसमें कई कोशिकाओं की सीमाएं गायब होती हैं। यह प्रभाव तब बढ़ जाता है जब ऊतक को विच्छेदन से पहले पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के साथ तय किया जाता है, क्योंकि प्रोटीन क्रॉसलिंक हो जाते हैं।
इंट्राविट्रल दवा वितरण पर अध्ययन से पता चला है कि पीछे के कक्ष में हाइपरोस्मोटिक समाधान के इंजेक्शन रेटिना डिटेचमेंट 2,3 को प्रेरित करते हैं। इन प्रयोगों में, 1,000 mOsm से 2,400 mOsm तक के विभिन्न समाधानों के 50 μL, को मध्य-विट्रस में इंजेक्ट किया गया, जिससे मिनटों के भीतर रेटिना डिटेचमेंट हुआ। विशेष रूप से, उच्च-परासरण समाधानों के लंबे एक्सपोजर के बाद भी, आरपीई तंग जंक्शन खरगोश औरबंदर दोनों आंखों के ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक छवियों में बरकरार दिखाई दिए। इसी तरह की रणनीति के बाद, हमने आरपीई विच्छेदन करने से पहले एक कुशल रेटिना डिटेचमेंट को प्रेरित करने के लिए डी-मैनिटोल के एक हाइपरोस्मोटिक समाधान को मध्य-विट्रियस में इंजेक्ट किया। चूंकि डी-मैनिटोल को आरपीई4 द्वारा नहीं ले जाया जाता है, इसलिए एक उच्च इंट्राविट्रल एकाग्रता बनाए रखी जाती है, जिससे आसमाटिक ढाल उत्पन्न होती है। पूरे पश्चवर्ती कक्ष में आरपीई और रेटिना का कुशल पृथक्करण आरपीई सेलुलर जंक्शनों के संरक्षण की गारंटी देता है और पूरे फ्लैटमाउंट पर आरपीई मॉर्फोमेट्री के अध्ययन की अनुमति देता है। इसके अलावा, हमने एक कृत्रिम बुद्धिमत्ता (एआई) -आधारित सॉफ्टवेयर विकसित किया है जो फ्लोरोसेंटली लेबल आरपीई सेल सीमाओं को पहचानता है और सेगमेंट करता है, 30 अलग-अलग आकार मैट्रिक्स को निर्धारित करता है, और विज़ुअलाइज़ेशन 5,6 के लिए प्रत्येक मीट्रिक के हीटमैप का उत्पादन करता है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके मानव आरपीई और रेटिना के सुसंगत और कुशल पृथक्करण को प्राप्त किया जा सकता है। यह विधि पूरे मानव रेटिना 5 में आरपीई आकार में क्षेत्रीय अंतरके अध्ययन की अनुमति देती है। प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम आरपीई और रेटिना का भौतिक पृथक्करण है। यदि कुछ क्षेत्रों में दो ऊतक पूरी तरह से अलग नहीं हैं, तो किसी को धीरे से रेटिना को उठाना चाहिए, यह सुनिश्चित करना चाहिए कि ऊतकों को तोड़ा न जाए। बड़े फ्लैटमाउंट के RESHAPE विश्लेषण को काफी रैम संसाधनों वाले सिस्टम के उपयोग की आवश्यकता हो सकती है। इस मामले में, प्रसंस्करण संसाधनों की कमी के बावजूद सॉफ्टवेयर को सफलतापूर्वक विश्लेषण पूरा करने की अनुमति देने के लिए पूरी छवि के पुनर्संयोजन को अक्षम किया जा सकता है।
मानव आरपीई फ्लैटमाउंट को विभाजित करने के लिए आरईएसएचएपीई का उपयोग करने की मुख्य सीमा यह है कि एआई एल्गोरिदम को ज्यादातर प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल-व्युत्पन्न आरपीई की छवियों पर प्रशिक्षित किया गया था। नतीजतन, मानव आरपीई फ्लैटमाउंट का विभाजन कम सटीक है। वृद्ध दाताओं से आरपीई कोशिकाओं में बड़ी मात्रा में लिपोफसिन7 होता है, और इसके ऑटोफ्लोरेसेंस का व्यापक स्पेक्ट्रम सेल सीमा विभाजन में हस्तक्षेप करता है। भविष्य में, इस तरह के नमूने में सेल सीमा विभाजन को बेहतर बनाने के लिए आरपीई फ्लैटमाउंट की अधिक छवियों का उपयोग किया जाएगा। इस सीमा के बावजूद, RESHAPE को विशेष रूप से आरपीई सेल सीमाओं को पहचानने और विभाजित करने के लिए प्रशिक्षित किया गया था और अन्य मौजूदा तरीकों की तुलना में बेहतर प्रदर्शन करता है, जैसे कि वोरोनोई8 और सेलप्रोफाइलर9 आरपीई कोशिकाओं का विभाजन।
इसके अलावा, मैनुअल विभाजन10 की तुलना में, RESHAPE बड़ी छवियों का जल्दी से विश्लेषण करने का लाभ प्रदान करता है (~ 130,000 पिक्सेल x 130,000 पिक्सेल का परीक्षण किया गया था)। अंत में, यह विच्छेदन विधि अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और इसे आसानी से अन्य पशु मॉडल तक बढ़ाया जा सकता है। इसके अलावा, सॉफ्टवेयर का उपयोग आंखों के फ्लैटमाउंट में आरपीई आकार का अध्ययन करने या कुछ उपचारों के प्रभाव की जांच करने के लिए सेल कल्चर मॉडल में किया जा सकता है। अंत में, RESHAPE की बहुमुखी प्रतिभा इसे अन्य प्रकार के उपकला कोशिकाओं के विश्लेषण के लिए व्यापक रूप से लागू करती है।
The authors have nothing to disclose.
हम ज़ीस एक्सियो स्कैन.जेड 1 के उपयोग के लिए नेशनल आई इंस्टीट्यूट (एनईआई) हिस्टोलॉजी कोर को धन्यवाद देते हैं। हम दानदाताओं, उनके परिवारों, एडवांसिंग साइट नेटवर्क और लायंस आई इंस्टीट्यूट को उनकी उदारता के लिए भी धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनईआई आईआरपी फंड (अनुदान संख्या ज़िया ईवाई000533-04) द्वारा समर्थित किया गया था।
Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
Vannas Spring Scissors – 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |