ヒトの眼の網膜から網膜色素上皮(RPE)を効率的に分離し、RPEの組織学的および形態学的解析のためにRPE/脈絡膜フラットマウント全体を生成する方法について説明します。
網膜色素上皮(RPE)と網膜は、機能的および構造的に接続された組織であり、光の知覚と視覚を調節するために連携して機能します。RPE頂端表面のタンパク質は、視細胞外側セグメント表面のタンパク質と密接に関連しているため、RPEを光受容体/網膜から一貫して分離することは困難です。ヒトの眼のRPEから網膜を効率的に分離し、光受容体とRPE細胞を別々の細胞解析のために完全なRPE/脈絡膜および網膜フラットマウントを生成する方法を開発しました。RPEによって輸送されない糖であるD-マンニトールの高浸透圧溶液の硝子体内注射は、RPE細胞接合部に損傷を与えることなく、後房全体にわたってRPEと網膜の分離を誘導した。網膜に付着したRPEパッチは観察されなかった。アクチンのファロイジン標識はRPE形状保存を示し、上皮全体の形態測定分析を可能にした。人工知能(AI)ベースのソフトウェアが開発され、RPEセルの境界を正確に認識してセグメント化し、30の異なる形状メトリックを定量化しました。この解剖法は再現性が高く、他の動物モデルにも容易に拡張することができます。
網膜色素上皮(RPE)と神経網膜は、光受容体のRPEへの強い生理学的依存性のために、互いに強く相互接続されています。解剖中、RPEからの神経網膜の機械的分離はRPE細胞の裂傷を引き起こし、RPEの頂端部分は網膜光受容体の外側セグメントに付着したままである。RPEと網膜の癒着の程度は非常に大きいため、分離後に網膜に残る色素の量を使用して、網膜の癒着の強さを定量化します1。具体的には、頂端側に位置するRPEタイトジャンクションとそれらをつなぐアクチン構造は、機械的分離中に切断される。したがって、細胞境界のRPEフラットマウントを染色すると、多くの細胞に境界が欠落している斑状の単分子膜が得られます。この効果は、タンパク質が架橋されるようになるにつれて、解剖前に組織がパラホルムアルデヒド(PFA)で固定されると悪化する。
硝子体内薬物送達に関する研究は、後房への高浸透圧溶液の注射が網膜剥離を誘発することを示した2,3。これらの実験では、1,000 mOsmから2,400 mOsmの範囲の50 μLの異なる溶液を硝子体中央部に注入すると、数分以内に網膜剥離を引き起こしました。特に、高浸透圧溶液に長時間さらされた後でも、RPEタイトジャンクションはウサギとサルの両方の目の透過型電子顕微鏡画像に無傷で現れました3。同様の戦略に従って、RPE解離を行う前に、D-マンニトールの高浸透圧溶液を硝子体中部に注入して、効率的な網膜剥離を誘導しました。D-マンニトールはRPE4によって輸送されないため、硝子体内濃度が高く維持され、浸透圧勾配が生成されます。後房全体にわたるRPEと網膜の効率的な分離は、RPE細胞接合の保存を保証し、フラットマウント全体のRPE形態測定の研究を可能にします。さらに、蛍光標識されたRPE細胞の境界を認識してセグメント化し、30の異なる形状メトリックを定量化し、視覚化のために各メトリックのヒートマップを生成する人工知能(AI)ベースのソフトウェアを開発しました5,6。
ヒトRPEと網膜の一貫した効率的な分離は、このプロトコルを使用して達成できます。この方法により、ヒト網膜全体にわたるRPE形状の地域差の研究が可能になります5。プロトコルの重要なステップは、RPEと網膜の物理的な分離です。2つの組織が一部の領域で完全に剥離していない場合は、網膜を静かに持ち上げて、組織を壊さないようにする必要があります。大型フラットマウントのREShAPE解析では、かなりのRAMリソースを備えたシステムの使用が必要になる場合があります。この場合、画像全体の再構成を無効にして、処理リソースが不足しているにもかかわらず、ソフトウェアが分析を正常に完了できるようにすることができます。
REShAPEを使用してヒトRPEフラットマウントをセグメント化することの主な制限は、AIアルゴリズムが主に人工多能性幹細胞由来RPEの画像でトレーニングされたことです。その結果、人間のRPEフラットマウントのセグメンテーションの精度が低下します。高齢ドナー由来のRPE細胞には大量のリポフスチン7が含まれており、その自家蛍光の広いスペクトルが細胞境界セグメンテーションを妨げます。将来的には、この種のサンプルの細胞境界セグメンテーションを改善するために、RPEフラットマウントのより多くの画像が使用される予定です。この制限にもかかわらず、REShAPEはRPE細胞の境界を認識してセグメント化するように特別に訓練されており、RPE細胞のボロノイ8 やセルプロファイラー9 セグメンテーションなどの他の既存の方法よりも優れたパフォーマンスを発揮します。
さらに、手動セグメンテーション10と比較して、REShAPEは大きな画像を迅速に分析できるという利点があります(~130,000ピクセルx 130,000ピクセルがテストされました)。結論として、この解剖方法は再現性が高く、他の動物モデルに容易に拡張することができます。さらに、このソフトウェアを使用して、目のフラットマウントまたは細胞培養モデルでRPE形状を研究し、特定の治療の効果を調べることができます。最後に、REShAPEの汎用性により、他のタイプの上皮細胞の分析に広く適用できます。
The authors have nothing to disclose.
Zeiss Axio Scan.Z1を使用してくださった国立眼科研究所(NEI)の組織学コアに感謝します。また、寄付者とその家族、アドバンス・サイト・ネットワーク、ライオンズ眼科研究所の寛大さにも感謝します。この作業は、NEI IRP基金(助成金番号ZIA EY000533-04)によって支援されました。
Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
Vannas Spring Scissors – 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |