Vi beskriver en metode for effektivt å skille retinalt pigmentepitel (RPE) fra netthinnen i menneskelige øyne og generere hele RPE / choroid flatmounts for histologiske og morfometriske analyser av RPE.
Retinalpigmentepitelet (RPE) og netthinnen er funksjonelt og strukturelt forbundet vev som jobber sammen for å regulere lysoppfattelse og syn. Proteiner på RPE-apikaloverflaten er tett forbundet med proteiner på fotoreseptorens ytre segmentoverflate, noe som gjør det vanskelig å konsekvent skille RPE fra fotoreceptorene / netthinnen. Vi utviklet en metode for effektivt å skille netthinnen fra RPE i menneskelige øyne for å generere komplette RPE / choroid og retina flatmounts for separat cellulær analyse av fotoreceptorer og RPE-celler. En intravitreal injeksjon av en høy-osmolaritet løsning av D-mannitol, et sukker som ikke transporteres av RPE, induserte separasjonen av RPE og netthinnen over hele bakre kammer uten å forårsake skade på RPE-cellekryssene. Ingen RPE-patcher ble observert festet til netthinnen. Phalloidin-merking av aktin viste bevaring av RPE-form og tillot morfometrisk analyse av hele epitelet. En kunstig intelligens (AI)-basert programvare ble utviklet for å nøyaktig gjenkjenne og segmentere RPE-cellegrensene og kvantifisere 30 forskjellige formberegninger. Denne disseksjonsmetoden er svært reproduserbar og kan enkelt utvides til andre dyremodeller.
Retinalpigmentepitelet (RPE) og nevrale retina er sterkt sammenkoblet med hverandre på grunn av den sterke fysiologiske avhengigheten av fotoreceptorene på RPE. Under disseksjon forårsaker den mekaniske separasjonen av nevrale retina fra RPE rive av RPE-cellene, med de apikale delene av RPE igjen festet til de ytre segmentene av retinale fotoreceptorer. Omfanget av RPE-retinal adhesjon er så stor at mengden pigment som er igjen på netthinnen etter separasjon, brukes til å kvantifisere styrken av retinal adhesjon1. Spesielt bryter RPE tette kryss og aktinstrukturen som forbinder dem, som er plassert på den apikale siden, av under mekanisk separasjon. Derfor vil farging av RPE-flatmontering for cellekantlinjer resultere i et ujevnt monolag der mange celler mangler kantlinjer. Denne effekten forverres når vevet er festet med paraformaldehyd (PFA) før disseksjon, da proteinene blir tverrbundet.
Studier på intravitreal legemiddellevering har vist at injeksjoner av hyperosmotiske løsninger i bakre kammer induserer retinal detachment 2,3. I disse forsøkene ble 50 μL forskjellige løsninger, alt fra 1,000 mOsm til 2,400 mOsm, injisert i midten av glasslegemet forårsaket retinal detachment i løpet av få minutter. Spesielt, selv etter lange eksponeringer for løsninger med høy osmolaritet, virket RPE-tette kryss intakte i transmisjonselektronmikroskopiske bilder av både kanin- og apeøyne3. Etter en lignende strategi injiserte vi i midten av glasslegemet en hyperosmotisk løsning av D-mannitol for å indusere en effektiv retinal detachment før du utfører RPE-disseksjon. Siden D-mannitol ikke transporteres av RPE4, opprettholdes en høy intravitreal konsentrasjon, noe som genererer en osmotisk gradient. Den effektive separasjonen av RPE og netthinnen over hele det bakre kammeret garanterer bevaring av RPE-cellekryssene og muliggjør studier av RPE-morfometri på hele flatfjellet. I tillegg utviklet vi en kunstig intelligens (AI)-basert programvare som gjenkjenner og segmenterer fluorescerende merkede RPE-cellegrenser, kvantifiserer 30 forskjellige formberegninger og produserer varmekart over hver beregning for visualisering 5,6.
Den konsekvente og effektive separasjonen av menneskelig RPE og netthinner kan oppnås ved hjelp av denne protokollen. Denne metoden gjør det mulig å studere regionale forskjeller i RPE-form over hele menneskelige netthinner5. Et avgjørende skritt i protokollen er den fysiske separasjonen av RPE og netthinnen. Hvis de to vevene ikke er helt løsrevet i enkelte områder, bør man forsiktig løfte netthinnen, slik at man ikke bryter vevet. REShAPE-analysen av store flatmounts kan kreve bruk av systemer med betydelige RAM-ressurser. I dette tilfellet kan remontering av hele bildet deaktiveres slik at programvaren kan fullføre analysen til tross for mangel på behandlingsressurser.
Hovedbegrensningen ved å bruke REShAPE til å segmentere menneskelige RPE-flatmounts er at AI-algoritmen for det meste ble trent på bilder av indusert pluripotent stamcelleavledet RPE. Som en konsekvens er segmenteringen av menneskelige RPE-flatmounts mindre nøyaktig. RPE-celler fra eldre givere inneholder en stor mengde lipofuscin7, og det brede spekteret av autofluorescens forstyrrer cellegrensesegmentering. I fremtiden vil flere bilder av RPE-flatmounts bli brukt til å forbedre cellegrensesegmentering i denne typen prøve. Til tross for denne begrensningen ble REShAPE spesielt opplært til å gjenkjenne og segmentere RPE-cellegrenser og presterer bedre enn andre eksisterende metoder, for eksempel Voronoi8 og CellProfiler9-segmentering av RPE-celler.
Sammenlignet med manuell segmentering 10 gir REShAPE dessuten fordelen av å analysere store bilder raskt (~130 000 piksler x130 000 piksler ble testet). Avslutningsvis er denne disseksjonsmetoden svært reproduserbar og kan lett utvides til andre dyremodeller. I tillegg kan programvaren brukes til å studere RPE-form i øyeflatmonterte eller i cellekulturmodeller for å undersøke effekten av visse behandlinger. Endelig gjør REShAPEs allsidighet det bredt anvendelig for analyse av andre typer epitelceller.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker histologikjernen til National Eye Institute (NEI) for bruken av Zeiss Axio Scan.Z1. Vi takker også giverne, deres familier, Advancing Sight Network og Lions Eye Institute for deres generøsitet. Dette arbeidet ble støttet av NEI IRP-midler (tilskuddsnummer ZIA EY000533-04).
Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
Vannas Spring Scissors – 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |