Describimos un método para separar eficientemente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) de la retina en los ojos humanos y generar montones planos completos de EPR / coroides para análisis histológicos y morfométricos del EPR.
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) y la retina son tejidos conectados funcional y estructuralmente que trabajan juntos para regular la percepción de la luz y la visión. Las proteínas en la superficie apical del EPR están estrechamente asociadas con las proteínas en la superficie del segmento externo del fotorreceptor, lo que dificulta la separación consistente del EPR de los fotorreceptores/retina. Desarrollamos un método para separar eficientemente la retina del EPR de los ojos humanos para generar montajes planos completos de EPR / coroides y retina para el análisis celular separado de los fotorreceptores y las células del EPR. Una inyección intravítrea de una solución de alta osmolaridad de D-manitol, un azúcar no transportado por el EPR, indujo la separación del EPR y la retina a través de toda la cámara posterior sin causar daño a las uniones celulares del EPR. No se observaron parches de EPR adheridos a la retina. El marcado de faloidina de la actina mostró la preservación de la forma del EPR y permitió el análisis morfométrico de todo el epitelio. Se desarrolló un software basado en inteligencia artificial (IA) para reconocer y segmentar con precisión los bordes celulares del EPR y cuantificar 30 métricas de forma diferentes. Este método de disección es altamente reproducible y puede extenderse fácilmente a otros modelos animales.
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) y la retina neural están fuertemente interconectados entre sí debido a la fuerte dependencia fisiológica de los fotorreceptores en el EPR. Durante la disección, la separación mecánica de la retina neural del EPR causa el desgarro de las células del EPR, con las porciones apicales del EPR unidas a los segmentos externos de los fotorreceptores de la retina. El grado de adhesión EPR-retina es tan grande que la cantidad de pigmento que queda en la retina después de la separación se utiliza para cuantificar la fuerza de la adhesión retiniana1. Específicamente, las uniones estrechas del EPR y la estructura de actina que las conecta, que se encuentran en el lado apical, se rompen durante la separación mecánica. Por lo tanto, la tinción de los montajes planos del EPR para los bordes de las celdas da como resultado una monocapa irregular en la que muchas células tienen bordes faltantes. Este efecto se exacerba cuando el tejido se fija con paraformaldehído (PFA) antes de la disección, a medida que las proteínas se reticulan.
Estudios sobre la administración intravítrea de fármacos han demostrado que las inyecciones de soluciones hiperosmóticas en la cámara posterior inducen desprendimiento de retina 2,3. En estos experimentos, 50 μL de diferentes soluciones, que van desde 1.000 mOsm a 2.400 mOsm, inyectados en el vítreo medio causaron desprendimiento de retina en cuestión de minutos. En particular, incluso después de largas exposiciones a soluciones de alta osmolaridad, las uniones estrechas del EPR aparecieron intactas en las imágenes microscópicas electrónicas de transmisión de ojos de conejo y mono3. Siguiendo una estrategia similar, inyectamos en el vítreo medio una solución hiperosmótica de D-manitol para inducir un desprendimiento de retina eficiente antes de realizar la disección del EPR. Como el D-manitol no es transportado por el EPR4, se mantiene una alta concentración intravítrea, generando un gradiente osmótico. La separación eficiente del EPR y la retina en toda la cámara posterior garantiza la preservación de las uniones celulares del EPR y permite el estudio de la morfometría del EPR en todo el montaje plano. Además, desarrollamos un software basado en inteligencia artificial (IA) que reconoce y segmenta los bordes celulares del EPR etiquetados con fluorescencia, cuantifica 30 métricas de forma diferentes y produce mapas de calor de cada métrica para la visualización 5,6.
La separación consistente y eficiente del EPR humano y las retinas se puede lograr utilizando este protocolo. Este método permite el estudio de las diferencias regionales en la forma del EPR en retinas humanas completas5. Un paso crucial en el protocolo es la separación física del EPR y la retina. Si los dos tejidos no están completamente separados en algunas áreas, uno debe levantar suavemente la retina, asegurándose de no romper los tejidos. El análisis REShAPE de grandes montajes planos puede requerir el uso de sistemas con considerables recursos de RAM. En este caso, el reensamblaje de toda la imagen se puede deshabilitar para permitir que el software finalice con éxito el análisis a pesar de la falta de recursos de procesamiento.
La principal limitación del uso de REShAPE para segmentar los montajes planos de EPR humano es que el algoritmo de IA se entrenó principalmente en imágenes de RPE derivado de células madre pluripotentes inducidas. Como consecuencia, la segmentación de los montajes planos del EPR humano es menos precisa. Las células del EPR de donantes envejecidos contienen una gran cantidad de lipofuscina7, y el amplio espectro de su autofluorescencia interfiere con la segmentación del borde celular. En el futuro, se utilizarán más imágenes de montajes planos de RPE para mejorar la segmentación del borde celular en este tipo de muestra. A pesar de esta limitación, REShAPE fue entrenado específicamente para reconocer y segmentar los bordes de las células del EPR y funciona mejor que otros métodos existentes, como la segmentación de células del EPR Voronoi8 y CellProfiler9 .
Además, en comparación con la segmentación manual 10, REShAPE ofrece la ventaja de analizar imágenes grandes rápidamente (se probaron ~ 130,000 píxeles x130,000 píxeles). En conclusión, este método de disección es altamente reproducible y puede extenderse fácilmente a otros modelos animales. Además, el software se puede utilizar para estudiar la forma del EPR en montajes planos de ojos o en modelos de cultivo celular para examinar el efecto de ciertos tratamientos. Finalmente, la versatilidad de REShAPE lo hace ampliamente aplicable para el análisis de otros tipos de células epiteliales.
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos al núcleo histológico del Instituto Nacional del Ojo (NEI) por el uso del Zeiss Axio Scan.Z1. También agradecemos a los donantes, sus familias, a Advancing Sight Network y al Lions Eye Institute por su generosidad. Este trabajo fue apoyado por los fondos NEI IRP (número de subvención ZIA EY000533-04).
Biopsy punch 1.5 mm | Acuderm Inc. | P1525 | |
Bovine albumin | MP Biomedicals | 160069 | |
Coverglass 50 x 75 mm, #1.5 thickness | Brain Research Laboratories | 5075-1.5D | |
Curved spatula | Katena | K3-6600 | |
D-Mannitol | Sigma | M9546 | |
DPBS 1x with Ca2+ and Mg2+ | Gibco | 14040-133 | |
Fine Scissors | Fine Science Tools | 14558-11 | |
Fluormount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
Forceps – Dumont #5 | Fine Science Tools | 11252-23 | |
Microscope slides 50 x 75 x 1.2 mm | Brain Research Laboratories | 5075 | |
Needles 21 G x 1-1/2" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305167 | |
Needles 27 G x 1-1/4" hypodermic | Becton Dickinson (BD) | 305136 | |
Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
Petri dish 100 mm | Corning | 430167 | |
Phalloidin-iFluor 647 | Abcam | ab176759 | |
Razor blades | PAL (Personna) | 62-0177 | |
Round bottom tubes 50 mL | Newegg | 9SIA4SR9M88854 | |
Silicon Elastomer Kit | Dow Corning Corporation | 4019862 | |
Square weighing boat (81 mm x 81 mm x 25 mm) | Sigma | W2876 | |
Surgical Vitrectomy System | BD Visitrec | 585100 | optional |
Syringe 1 mL | Becton Dickinson (BD) | 309659 | |
Triton X-100 | Sigma | T9284 | |
TrueBlack | Biotium | 23007 | autofluorescence quencher |
Tween 20 | Affymetrix | 20605 | |
Vannas Spring Scissors – 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-10 |