Etablering af en diafyseal lårbensfrakturmodel hos mus
Summary
Denne protokol beskriver en kirurgisk procedure til etablering af en diafyseal fraktur i lårbenet hos mus, som stabiliseres med en intramedullær ledning, til brudhelingsundersøgelser.
Abstract
Knogler har en betydelig regenerativ kapacitet. Imidlertid er brudheling en kompleks proces, og afhængigt af sværhedsgraden af læsionerne og patientens alder og generelle sundhedsstatus kan der opstå fejl, hvilket fører til forsinket forening eller ikke-union. På grund af det stigende antal brud som følge af højenergitraumer og aldring er der et presserende behov for udvikling af innovative terapeutiske strategier til forbedring af knoglereparation baseret på kombinationen af skelet-/mesenkymale stamceller/stromale celler og biomimetiske biomaterialer. Til dette formål er brugen af pålidelige dyremodeller grundlæggende for bedre at forstå de vigtigste cellulære og molekylære mekanismer, der bestemmer helingsresultaterne. Af alle modellerne er musen den foretrukne forskningsmodel, fordi den tilbyder en bred vifte af transgene stammer og reagenser til eksperimentel analyse. Imidlertid kan etablering af brud hos mus være teknisk udfordrende på grund af deres lille størrelse. Derfor har denne artikel til formål at demonstrere procedurerne for kirurgisk etablering af en diafyseal lårbensbrud hos mus, som er stabiliseret med en intramedullær ledning og ligner den mest almindelige knoglereparationsproces gennem bruskcallusdannelse.
Introduction
Skelettet er et vitalt og funktionelt alsidigt organ. Skeletets knogler muliggør kropsholdning og bevægelse, beskytter de indre organer, producerer hormoner, der integrerer fysiologiske reaktioner, og er stedet for hæmatopoiesis og mineralopbevaring1. Hvis brækket, knogler har en bemærkelsesværdig evne til at regenerere og fuldt ud genoprette deres præ-skade form og funktion. Helingsprocessen begynder med dannelsen af et hæmatom og et inflammatorisk respons, som inducerer aktivering og kondensering af skeletstamceller / stamceller fra periosteum, endosteum og knoglemarv og deres efterfølgende differentiering til dannelse af den bløde bruskcallus. Brobygningen af de brudte ender sker derefter gennem en proces, der ligner endokondral knogledannelse, hvor det bruskstillads udvider og derefter mineraliserer og danner den hårde osseøse callus. Endelig ombygges den hårde callus gradvist af osteoklaster og osteoblaster for at genoprette den oprindelige knoglestruktur 2,3.
Selvom brudhelingsprocessen er ret robust, involverer den en indviklet opsummering af begivenheder og påvirkes signifikant af flere individuelle faktorer, herunder patientens generelle sundhedsstatus, alder og køn samt skadefaktorer, såsom tilstanden for mekanisk stabilisering af den brækkede knogle, forekomsten af infektion og sværhedsgraden af den omgivende bløddelsskade4, 5,6. Derfor er fejl almindelige, hvilket fører til udvikling af ikke-fagforening, hvilket i høj grad påvirker patientens rehabilitering og livskvalitet 7,8. På grund af det stigende antal brud som følge af højenergitraumer og aldring samt de høje omkostninger ved behandlinger er ikke-fagforeningsfrakturer blevet en byrde for sundhedssystemer over hele verden 9,10. Denne stigende byrde understreger det presserende behov for innovative terapeutiske strategier til forbedring af knoglereparation11,12 baseret på kombinationen af skelet / mesenkymale stamceller / stromale celler og biomimetiske biomaterialer13,14.
I forfølgelsen af dette mål er dyremodeller blevet brugt i vid udstrækning i undersøgelser, der sigter mod at forstå den grundlæggende biologi af brudhelingsmekanismer og i proof-of-concept prækliniske undersøgelser, der sigter mod at udtænke nye terapeutiske strategier til fremme af knoglereparation 15,16,17. Modeller med små dyr, såsom mus, er fremragende til frakturhelingsundersøgelser på grund af den brede tilgængelighed af genetisk modificerede stammer og reagenser til eksperimentelle analyser og deres lave vedligeholdelsesomkostninger. Derudover har mus et hurtigt helingstidsforløb, som giver mulighed for tidsmæssig analyse af alle faser af reparationsprocessen15. Imidlertid kan dyrets lille størrelse udgøre udfordringer for kirurgisk produktion af brud med fikseringstilstande svarende til dem, der anvendes hos mennesker. Denne protokol beskriver en enkel og billig model for brudheling hos mus ved hjælp af en åben lårbensosteotomi stabiliseret med en intramedullær ledning, der ligner den mest almindelige knoglereparationsproces gennem bruskhård dannelse og kan bruges både i grundlæggende og translationelle undersøgelser, hvor adgang til brudstedet er påkrævet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Da antallet af brud stiger på verdensplan 9,10,25, bliver innovative behandlinger for ikke-fagforeninger stadig mere presserende. Da frakturheling involverer en kompleks og stramt orkestreret opsummering af begivenheder, der opstår over en lang tidsskala3, er brugen af gyldige dyremodeller central for at forbedre vores forståelse af de mekanismer, der bestemmer succesen med knoglereparation og for at v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Carlos Chagas Filho Foundation for Research Support of the State of Rio de Janeiro (FAPERJ).
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
References
- Florencio-Silva, R., Sasso, G. R., Sasso-Cerri, E., Simoes, M. J., Cerri, P. S. Biology of bone tissue: Structure, function, and factors that influence bone cells. BioMed Research International. 2015, 421746 (2015).
- Bahney, C. S., et al. Cellular biology of fracture healing. Journal of Orthopedic Research. 37 (1), 35-50 (2019).
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: Mechanisms and interventions. Nature Reviews Rheumatology. 11 (1), 45-54 (2015).
- Perren, S. M. Fracture healing: Fracture healing understood as the result of a fascinating cascade of physical and biological interactions. Part II. Acta Chirurgiae Orthopaedicae et Traumatologiae Cechoslovaca. 82 (1), 13-21 (2015).
- Giannoudis, P. V., Krettek, C., Lowenberg, D. W., Tosounidis, T., Borrelli, J. Fracture healing adjuncts-The world’s perspective on what works. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 43-47 (2018).
- Kates, S. L., et al. Outside the bone: What is happening systemically to influence fracture healing. Journal of Orthopaedic Trauma. 32, 33-36 (2018).
- Ding, Z. C., Lin, Y. K., Gan, Y. K., Tang, T. T. Molecular pathogenesis of fracture nonunion. Journal of Orthopaedic Translation. (14), 45-56 (2018).
- Calori, G. M., et al. Non-unions. Clinical Cases in Mineral Bone Metabolism. 14 (2), 186-188 (2017).
- Ekegren, C. L., Edwards, E. R., de Steiger, R., Gabbe, B. J. Incidence, costs and predictors of non-union, delayed union and mal-union following long bone fracture. Internation Journal of Environmental Research and Public Health. 15 (12), 2845 (2018).
- Aziziyeh, R., et al. The burden of osteoporosis in four Latin American countries: Brazil, Mexico, Colombia, and Argentina. Journal of Medical Economics. 22 (7), 638-644 (2019).
- Kostenuik, P., Mirza, F. M. Fracture healing physiology and the quest for therapies for delayed healing and nonunion. Journal of Orthopaedic Research. 35 (2), 213-223 (2017).
- Gomez-Barrena, E., et al. fracture healing: cell therapy in delayed unions and nonunions. Bone. 70, 93-101 (2015).
- Schlundt, C., et al. Clinical and research approaches to treat non-union fracture. Current Osteoporosis Reports. 16 (2), 155-168 (2018).
- Gomez-Barrena, E., et al. Feasibility and safety of treating non-unions in tibia, femur and humerus with autologous, expanded, bone marrow-derived mesenchymal stromal cells associated with biphasic calcium phosphate biomaterials in a multicentric, non-comparative trial. Biomaterials. 196, 100-108 (2018).
- Ryan, G., et al. Systemically impaired fracture healing in small animal research: A review of fracture repair models. Journal of Orthopedic Research. 39 (7), 1359-1367 (2021).
- Marmor, M. T., Dailey, H., Marcucio, R., Hunt, A. C. Biomedical research models in the science of fracture healing – Pitfalls & promises. Injury. 51 (10), 2118-2128 (2020).
- Schindeler, A., Mills, R. J., Bobyn, J. D., Little, D. G. Preclinical models for orthopedic research and bone tissue engineering. Journal of Orthopedic Research. 36 (3), 832-840 (2018).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (2), 5563 (2011).
- Stollings, L. M., et al. Immune modulation by volatile anesthetics. Anesthesiology. 125 (2), 399-411 (2016).
- Sedghi, S., Kutscher, H. L., Davidson, B. A., Knight, P. R. Volatile anesthetics and immunity. Immunological Investigations. 46 (8), 793-804 (2017).
- Tsukamoto, A., Serizawa, K., Sato, R., Yamazaki, J., Inomata, T. Vital signs monitoring during injectable and inhalant anesthesia in mice. Experimental Animals. 64 (1), 57-64 (2015).
- Komárek, V., Hedrich, H. J. Chapter 2.2. Gross anatomy. The Laboratory Mouse (Second Edition). , 145-159 (2012).
- Amend, S. R., Valkenburg, K. C., Pienta, K. J. Murine hind limb long bone dissection and bone marrow isolation. Journal of Visualized Experiments. (110), e53936 (2016).
- An, Y. H., Moreira, P. L., Kang, Q. K., Gruber, H. E., An, Y. H., Martin, K. L. Principles of embedding and common protocols. Handbook of Histology Methods for Bone and Cartilage. , 185-197 (2003).
- Enninghorst, N., McDougall, D., Evans, J. A., Sisak, K., Balogh, Z. J. Population-based epidemiology of femur shaft fractures. Journal of Trauma and Acute Care Surgery. 74 (6), 1516-1520 (2013).
- Gunderson, Z. J., Campbell, Z. R., McKinley, T. O., Natoli, R. M., Kacena, M. A. A comprehensive review of mouse diaphyseal femur fracture models. Injury. 51 (7), 1439-1447 (2020).
- Haffner-Luntzer, M., Fischer, V., Ignatius, A. Differences in fracture healing between female and male C57BL/6J mice. Frontiers in Physiology. 12, 712494 (2021).
- Bonnarens, F., Einhorn, T. A. Production of a standard closed fracture in laboratory animal bone. Journal of Orthopaedic Research. 2 (1), 97-101 (1984).
- Streubel, P. N., Desai, P., Suk, M. Comparison of RIA and conventional reamed nailing for treatment of femur shaft fractures. Injury. 41, 51-56 (2010).
