Estabelecimento de um Modelo de Fratura Diafisária do Fêmur em Camundongos
Summary
Este protocolo descreve um procedimento cirúrgico para o estabelecimento de uma fratura diafisária no fêmur de camundongos, que é estabilizada com um fio intramedular, para estudos de consolidação da fratura.
Abstract
Os ossos têm uma capacidade regenerativa significativa. No entanto, a consolidação da fratura é um processo complexo e, dependendo da gravidade das lesões e da idade e estado geral de saúde do paciente, falhas podem ocorrer, levando ao retardo da consolidação ou não união. Devido ao crescente número de fraturas resultantes do trauma de alta energia e do envelhecimento, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas inovadoras para melhorar o reparo ósseo baseado na combinação de células-tronco esqueléticas/mesenquimais/estromas e biomateriais biomiméticos é urgentemente necessário. Para tanto, o uso de modelos animais confiáveis é fundamental para o melhor entendimento dos principais mecanismos celulares e moleculares que determinam os desfechos da cicatrização. De todos os modelos, o camundongo é o modelo de pesquisa preferido porque oferece uma grande variedade de cepas transgênicas e reagentes para análise experimental. No entanto, o estabelecimento de fraturas em camundongos pode ser tecnicamente desafiador devido ao seu pequeno tamanho. Portanto, este artigo tem como objetivo demonstrar os procedimentos para o estabelecimento cirúrgico de uma fratura de fêmur diafisária em camundongos, que é estabilizada com um fio intramedular e se assemelha ao processo de reparo ósseo mais comum, através da formação de calo cartilaginoso.
Introduction
O esqueleto é um órgão vital e funcionalmente versátil. Os ossos do esqueleto possibilitam a postura e o movimento corporal, protegem os órgãos internos, produzem hormônios que integram as respostas fisiológicas e são o local de hematopoese e armazenamento de minerais1. Se fraturados, os ossos têm uma notável capacidade de se regenerar e restaurar totalmente sua forma e função pré-lesão. O processo cicatricial inicia-se com a formação de um hematoma e uma resposta inflamatória, que induz a ativação e condensação de células-tronco esqueléticas/progenitoras do periósteo, endósteo e medula óssea e sua posterior diferenciação para formar o calo cartilaginoso mole. A ponte das extremidades fraturadas ocorre, então, por um processo que se assemelha à formação óssea endocondral, na qual o arcabouço cartilaginoso se expande e depois mineraliza, formando o calo ósseo duro. Finalmente, o calo duro é gradualmente remodelado por osteoclastos e osteoblastos para restaurar a estrutura ósseaoriginal2,3.
Embora o processo de consolidação da fratura seja bastante robusto, envolve um intrincado somatório de eventos e é significativamente influenciado por vários fatores individuais, incluindo o estado geral de saúde, idade e sexo do paciente, bem como fatores de lesão, como o modo de estabilização mecânica do osso fraturado, a ocorrência de infecção e a gravidade da lesão de tecidos moles circundante4, 5.6. Portanto, falhas são comuns, levando ao desenvolvimento da pseudoartrose, o que impacta sobremaneira a reabilitação e a qualidade de vida dospacientes7,8. Devido ao crescente número de fraturas como resultado do trauma de alta energia e do envelhecimento, bem como aos altos custos dos tratamentos, as fraturas de pseudoartrose tornaram-se um fardo para os sistemas de saúde em todo omundo9,10. Essa carga crescente destaca a necessidade urgente de estratégias terapêuticas inovadoras para melhorar o reparoósseo11,12 baseadas na combinação de células-tronco esqueléticas/mesenquimais/estromas e biomateriais biomiméticos13,14.
Em busca desse objetivo, modelos animais têm sido amplamente utilizados em estudos visando compreender a biologia fundamental dos mecanismos de consolidação de fraturas e em estudos pré-clínicos de prova de conceito com o objetivo de elaborar novas estratégias terapêuticas para promover o reparo ósseo15,16,17. Modelos de pequenos animais, como o camundongo, são excelentes para estudos de consolidação de fraturas devido à ampla disponibilidade de cepas e reagentes geneticamente modificados para análises experimentais e seus baixos custos de manutenção. Além disso, os camundongos apresentam um rápido curso de cicatrização, o que permite a análise temporal de todas as etapas do processo de reparo15. Entretanto, o pequeno tamanho do animal pode representar desafios para a produção cirúrgica de fraturas com modos de fixação semelhantes aos aplicados em humanos. Este protocolo descreve um modelo simples e de baixo custo de consolidação de fraturas em camundongos utilizando osteotomia femoral aberta estabilizada com fio intramedular, que se assemelha ao processo de reparo ósseo mais comum, através da formação de calo cartilaginoso, e pode ser utilizado tanto em investigações básicas quanto translacionais em que o acesso ao local da fratura é necessário.
Protocol
Representative Results
Discussion
À medida que o número de fraturas aumenta em todo o mundo9,10,25, tratamentos inovadores para a pseudoartrose estão se tornando cada vez mais urgentes. Como a consolidação de fraturas envolve uma soma complexa e fortemente orquestrada de eventos que ocorrem em uma longa escala detempo3, o uso de modelos animais válidos é fundamental para melhorar nossa compreensão dos mecanismos que determinam o s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ).
Materials
| Alcohol 70º | Merck | 109-56-8 | Or any general available supplier |
| Canada balsam (mounting medium) | Merck | C1795 | Or any general available supplier |
| Cefazoline | ABL | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Coverslip | Merck | CSL284525 | Or any general available supplier |
| Dental X-Ray Generator | Focus | – | Sold by Instrumentarium Dental Inc. |
| DEPC water | Merck | W4502 | Or any general available supplier |
| Dissecting Scissor | ABC Instrumentos | 0327 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| EDTA | Vetec | 60REAVET014340 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Eosin solution | Laborclin | EA-65 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Ethanol P.A | Vetec | 60REAVET012053 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Gauze pads | Cremer | Not applicable | Or any general available supplier |
| Harris Hematoxylin Solution | Laborclin | 620503 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Heating pad | Tonkey Electrical Technology | E114273 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Histological slides | Merck | CSL294875X25 | Or any general available supplier |
| Histology cassettes | Merck | H0542-1CS | Or any general available supplier |
| Hydrochloric acid – 37% | Merck | 258148 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Insulin syringe | BD | 324918 | Or any general available supplier |
| Iodopovidone sponge | Rioquímica | 372106 | Or any general available supplier |
| Ketamine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Lacribel collyrium | Cristalia | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Microtome | Leica | 149AUTO00C1 | |
| Mouse Tooth Forceps Tweezer | ABC Instrumentos | 0164 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Needle 26 G | BD | 2239 | Or any general available supplier |
| Needle Holder | Golgran | 135-18 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Nonresorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1546-NT | Or any general available supplier |
| Paraffin | Exodo | 8002 – 74 – 2 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Paraformaldehyde | Sigma | 30525-89-4 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| PBS 1x | Lonza | BE17-516F | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Resorbable Nylon Suture thread nº 6 | Atramat | C1596-45B | Or any general available supplier |
| Rod Wire SS CrNi 0.016" | Orthometric | 56.50.2016 | |
| Scalpel nº 11 | Descarpak | 15782 | Or any general available supplier |
| Serrated Tip Tweezer | Quinelato | QC.404.12 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Shaver | Phillips | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Surgical tape | 3M | 2734 | Or any general available supplier |
| Surgical tnt field | Polarfix | 6153 | Or any general available supplier |
| Tramadol hydrochloride | Teuto | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Water bath for histology | Leica | HI1210 | |
| Xylazine hydrochloride | Ceva | Not applicable | Similar brands of the item may be used according to local availability |
| Xylene | Dinamica | 60READIN001105 | Similar brands of the item may be used according to local availability |
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