化学発光アッセイによるイネの免疫応答における活性酸素種産生のリアルタイム検出
Summary
ここでは、病原体関連分子パターン誘発免疫応答におけるイネ組織における遊性活性酸素種(ROS)産生をリアルタイムに検出する方法について述べる。この方法はシンプルで標準化されており、制御された条件下で再現性の高い結果を生成します。
Abstract
活性酸素種(ROS)は、非生物的および生物的ストレスの感知を含む、さまざまな生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たします。病原体の感染または病原体関連化学物質(病原体関連分子パターン[PAMP])への挑戦により、ROSバーストを含む一連の免疫応答が植物に迅速に誘導され、これはPAMPトリガー免疫(PTI)と呼ばれます。ROSバーストは特徴的なPTI応答であり、原形質膜に局在するNADPHオキシダーゼ(RBOHファミリータンパク質)のグループによって触媒されます。ROSの大部分は過酸化水素(H2O2)を含み、ルミノールベースの化学発光法によって容易かつ着実に検出することができる。化学発光は、ルミノールまたはその誘導体(L-012など)が触媒の作用下でROSと酸化還元反応を起こす光子生成反応です。本論文では、イネ組織におけるPAMP誘発時にアポプラストROS産生をリアルタイムで検出するための最適化されたL-012ベースの化学発光法について説明します。この方法は、しっかりと制御された条件下で、簡単で、安定しており、標準化されており、再現性が高いです。
Introduction
活性酸素種(ROS)は、スーパーオキシドアニオンラジカル(O2-)およびその誘導体、ヒドロキシルラジカル(OH–)、過酸化水素、および一重項酸素または酸化還元反応の生成物を含む一連の化学的に活性な酸素誘導体を含み、色素体および葉緑体、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、およびその他の細胞内位置で絶えず生成されます1。.ROSは多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしており、すべての植物にとって不可欠です2,3,4。ROS機能の幅広いスペクトルは、成長と発達の調節から非生物的および生物的ストレスの知覚までさまざまです5,6,7,8。
植物免疫系では、植物細胞原形質膜に局在する受容体、いわゆるパターン認識受容体(PRR)が病原体由来の化学物質-病原体関連分子パターン(PAMP)を知覚します。この認識は、カルシウム流入、ROSバースト、MAPKカスケードなどの一連の高速免疫応答を引き起こします。したがって、この免疫層はPAMPトリガー免疫(PTI)と呼ばれます。ROSバーストは特徴的なPTI応答であり、その決定はPTI関連の研究に広く適用されています9,10。PAMPによって引き起こされるROS産生は、細胞質質NADPHまたはNADHから細胞外酸素に電子を移動してスーパーオキシド(O 2–)を生成し、スーパーオキシドジスムターゼ8によって自発的に過酸化水素(H 2 O 2)に変換される原形質膜常在型NADPHオキシダーゼ、または呼吸バーストオキシダーゼホモログ(RBOH)ファミリータンパク質に起因します。.PAMPトリガーROSバーストは非常に速く、PAMP治療後わずか数分で現れ、~10〜12分でピークに達します。ROS分子の大部分は過酸化水素(H 2 O2)を含み、これは化学発光アッセイで容易かつ着実に検出することができる。
化学発光においては、化学発光試薬は活性酸素と反応し、触媒の作用により、励起状態中間体を生成する。その後、生成物中の電子は非放射遷移によって基底状態に戻り、光子を放出する。一般的な化学発光試薬には、ルミノールおよびL-012が含まれ、ルミノールがアプリケーションを支配しています11、12、13。しかし、L-012はルミノールと比較して中性または中性に近いpH条件下ではるかに高い発光効率を有するため、より多くの研究者がROS産生を検出するためにL-012を選択しています。
本稿では,イネ(Oryza sativa)組織-葉板および鞘中のPAMPs誘発後のROS産生をリアルタイムに検出するためのL-012に基づく最適化された化学発光法について述べる。ここで提供される方法は、シンプルで安定しており、標準化されており、さまざまな実験ニーズを満たすために高度に適応可能です。この方法で得られたデータは、しっかりと制御された条件下で再現性が高いです。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究の目的は、イネ組織におけるPAMPに応答した初期ROS産生を非常に効率的に定量する方法を確立することである。この方法は、処理されたイネ組織から産生されたアポプラストROSをリアルタイムで測定するための標準化された手順を提供します。この方法は、操作が簡単で、低コストで、組成が明確で、市販のキットとは無関係です。この方法を使用すると、研究者は、植物が生物的また…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、上海 自然科学基金会(研究課題番号:21ZR1429300/BS1500016)、上海交通大学(Agri-Xプログラム、研究課題番号:AF1500088/002)、上海農業種子共同イノベーションセンター(研究課題番号:ZXWH2150201/001)から江波ファン氏への助成金、上海交通大学医工連携プロジェクト(課題番号:21X010301734)のカン・リー氏の助成を受けて行われました。
Materials
| 96-well microtiter plate | WHB | WHB-96-01 | |
| Ethanol absolute | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-amino-5-chloro-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazine-1,4-dione, CAS #:143556-24-5 |
| Microplate reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase from horseradish (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Sucrose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
References
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