Développement rapide de circuits d’identification de l’état cellulaire avec poly-transfection

Summary

Les circuits génétiques complexes prennent beaucoup de temps à concevoir, à tester et à optimiser. Pour faciliter ce processus, les cellules de mammifères sont transfectées de manière à permettre de tester plusieurs stœchiométrie des composants du circuit dans un seul puits. Ce protocole décrit les étapes de la planification expérimentale, de la transfection et de l’analyse des données.

Abstract

Les circuits génétiques des mammifères ont démontré le potentiel de détecter et de traiter un large éventail d’états pathologiques, mais l’optimisation des niveaux de composants du circuit reste difficile et exigeante en main-d’œuvre. Pour accélérer ce processus, notre laboratoire a développé la poly-transfection, une extension à haut débit de la transfection traditionnelle des mammifères. Dans la poly-transfection, chaque cellule de la population transfectée effectue essentiellement une expérience différente, testant le comportement du circuit à différents nombres de copies d’ADN et permettant aux utilisateurs d’analyser un grand nombre de stœchiométrie dans une réaction à pot unique. Jusqu’à présent, des polytransfections qui optimisent les rapports des circuits à trois composants dans un seul puits de cellules ont été démontrées; En principe, la même méthode peut être utilisée pour le développement de circuits encore plus grands. Les résultats de la polytransfection peuvent être facilement appliqués pour trouver des rapports optimaux d’ADN à co-transfect pour les circuits transitoires ou pour choisir des niveaux d’expression pour les composants du circuit pour la génération de lignées cellulaires stables.

Ici, nous démontrons l’utilisation de la poly-transfection pour optimiser un circuit à trois composants. Le protocole commence par des principes de conception expérimentale et explique comment la polytransfection s’appuie sur les méthodes traditionnelles de co-transfection. Ensuite, la poly-transfection des cellules est réalisée et suivie d’une cytométrie en flux quelques jours plus tard. Enfin, les données sont analysées en examinant des tranches des données de cytométrie en flux unicellulaire qui correspondent à des sous-ensembles de cellules avec certains rapports de composants. En laboratoire, la polytransfection a été utilisée pour optimiser les classificateurs cellulaires, les contrôleurs de rétroaction et de feedforward, les motifs bistables et bien d’autres. Cette méthode simple mais puissante accélère les cycles de conception de circuits génétiques complexes dans les cellules de mammifères.

Introduction

Le domaine de la biologie synthétique des mammifères a rapidement progressé, passant du développement de simples parties sensorielles et réactives dans des lignées cellulaires cultivées à l’optimisation de réseaux complexes de gènes pour relever les défis du monde réel en matière de diagnostic et de thérapeutique¹. Ces circuits sophistiqués sont capables de détecter les entrées biologiques des profils de microARN aux cytokines en passant par les médicaments à petites molécules, et de mettre en œuvre des circuits de traitement logique, notamment des transistors, des filtres passe-bande, des interrupteurs à bascule et des oscillateurs. Ils ont également montré des résultats prometteurs dans des modèles animaux de maladies comme le cancer, l’arthrite, le diabète et bien d’autres 1,2,3,4,5. Cependant, à mesure que la complexité d’un circuit augmente, l’optimisation des niveaux de chacun de ses composants devient de plus en plus difficile.

Un type de circuit génétique particulièrement utile est un classificateur cellulaire, qui peut être programmé pour détecter et répondre aux états cellulaires. La production sélective de protéines ou d’ARN dans des états cellulaires spécifiques est un outil puissant pour guider et programmer la différenciation des cellules et des organoïdes, identifier et détruire les cellules malades et/ou les types de cellules indésirables, et réguler la fonction des cellules thérapeutiques 1,2,3,4,5 . Cependant, la création de circuits dans les cellules de mammifères capables de classer avec précision les états cellulaires de plusieurs espèces d’ARN cellulaire et / ou de protéines a été très difficile.

L’une des étapes les plus chronophages du développement d’un circuit de classification cellulaire consiste à optimiser les niveaux d’expression relatifs des gènes composants individuels, tels que les capteurs et les facteurs de traitement, dans le circuit. Pour accélérer l’optimisation des circuits et permettre la construction de circuits plus sophistiqués, des travaux récents ont utilisé la modélisation mathématique des circuits de classificateur de cellules et de leurs composants pour prédire des compositions et des topologies optimales ^6,7. Bien que cela ait montré des résultats puissants jusqu’à présent, l’analyse mathématique est limitée par la nécessité de caractériser systématiquement le comportement d’entrée-sortie des gènes composant dans le circuit, ce qui prend du temps. En outre, une myriade de problèmes dépendants du contexte peuvent émerger dans des circuits génétiques complexes, ce qui fait que le comportement d’un circuit complet défie les prédictions basées sur des caractérisations de parties individuelles ^8,9.

Pour développer et tester plus rapidement des circuits complexes de mammifères tels que les classificateurs d’état cellulaire, notre laboratoire a développé une technique appelée poly-transfection¹⁰, une évolution des protocoles de co-transfection plasmidique. Dans la co-transfection, plusieurs espèces d’ADN plasmidique sont complexées avec un réactif lipidique ou polymère chargé positivement, puis livrées aux cellules de manière corrélée (Figure 1A). Dans la polytransfection, les plasmides sont complexés séparément avec le réactif, de sorte que l’ADN de chaque complexe de transfection est livré aux cellules de manière décorrélée (Figure 1B). En utilisant cette méthode, les cellules de la population transfectée sont exposées à de nombreuses combinaisons de rapports de deux charges utiles d’ADN ou plus portant différents composants de circuit.

Pour mesurer les rapports des composants du circuit délivrés à chaque cellule, chaque complexe de transfection au sein d’une polytransfection contient un rapporteur fluorescent exprimé de manière constitutive qui sert d’indicateur de l’absorption cellulaire du complexe. L’ADN de remplissage qui ne contient aucun élément actif dans une cellule de mammifère est utilisé pour ajuster la quantité relative du rapporteur fluorescent et des composants du circuit livrés à une cellule dans un seul complexe de transfection et est discuté plus en détail dans la discussion. Un exemple d’ADN de remplissage utilisé dans le laboratoire Weiss est un plasmide contenant une séquence terminatrice, mais pas de promoteur, de séquence codante, etc. Les cellules avec différents ratios de composants de circuit peuvent ensuite être comparées pour trouver des rapports optimaux pour la fonction du circuit génétique. Cela donne à son tour des prédictions utiles pour choisir les promoteurs et autres éléments du circuit afin d’atteindre des niveaux optimaux d’expression génique lors de la combinaison de composants de circuit en un seul vecteur d’intégration génétique (par exemple, un lentivirus, un transposon ou une aire d’atterrissage). Ainsi, au lieu de choisir des rapports entre les composants du circuit en fonction de l’intuition ou d’un processus d’essais et d’erreurs fastidieux, la polytransfection évalue un large éventail de stœchiométrie entre les parties génétiques dans une réaction à pot unique.

Dans notre laboratoire, la polytransfection a permis l’optimisation de nombreux circuits génétiques, y compris les classificateurs cellulaires, les contrôleurs de rétroaction et de feedforward, et les motifs bistables. Cette méthode simple mais puissante accélère considérablement les cycles de conception de circuits génétiques complexes dans les cellules de mammifères. La polytransfection a depuis été utilisée pour caractériser plusieurs circuits génétiques afin de révéler leurs fonctions de transfert d’entrées-sorties multidimensionnelles à haute résolution 10, d’optimiser une topologie de circuit alternative pour la classification de l’état cellulaire¹¹ et d’accélérer divers projets publiés^12,13 et en cours.

Nous décrivons et décrivons ici le flux de travail pour utiliser la polytransfection afin d’optimiser rapidement un circuit génétique (Figure 2). Le protocole montre comment générer des données de polytransfection de haute qualité et éviter plusieurs erreurs courantes dans le protocole de polytransfection et l’analyse des données (Figure 3). Il montre ensuite comment utiliser la polytransfection pour caractériser des composants de circuits simples et, ce faisant, comparer les résultats de la polytransfection à la co-transfection (Figure 4). Enfin, les résultats de la poly-transfection montrent une optimisation du circuit classificateur du cancer (Figure 5).

Protocol

NOTE: Les tableaux 1 et 2 servent de références importantes pour ce protocole. Le tableau 1 montre la mise à l’échelle des réactifs pour les réactions, et le tableau 2 montre l’arithmétique du rapport ADN pour un exemple de polytransfection décrit dans le protocole (moitié supérieure) et pour une éventuelle expérience de suivi (moitié inférieure). 1. Préparation des cellules pour la transfection</stron…

Representative Results

Dans la figure 1, nous comparons la co-transfection à la poly-transfection. Dans une co-transfection, tous les plasmides sont livrés dans le même mélange de transfection, ce qui entraîne une forte corrélation entre la quantité de chaque plasmide qu’une seule cellule reçoit (Figure 1A). Bien que le nombre total de plasmides délivrés à chaque cellule varie considérablement, la fluorescence des deux protéines rapporteures dans les cellules individuel…

Discussion

Les méthodes de prototypage rapide telles que la conception assistée par ordinateur (CAO), la planche à pain et l’impression 3D ont révolutionné les disciplines mécaniques, électriques et de génie civil. La capacité de rechercher rapidement de nombreuses solutions possibles à un défi donné accélère considérablement les progrès dans un domaine. Nous pensons que la polytransfection est une technologie analogue pour le génie biologique, permettant le prototypage rapide de circuits génétiques. De plus, d…

Materials

15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI