Rask utvikling av celletilstandsidentifikasjonskretser med poly-transfeksjon

Summary

Komplekse genetiske kretser er tidkrevende å designe, teste og optimalisere. For å lette denne prosessen transfekderes pattedyrceller på en måte som tillater testing av flere støkiometrier av kretskomponenter i en enkelt brønn. Denne protokollen skisserer trinnene for eksperimentell planlegging, transfeksjon og dataanalyse.

Abstract

Pattedyrs genetiske kretser har vist potensialet til å fornemme og behandle et bredt spekter av sykdomstilstander, men optimalisering av nivåene av kretskomponenter er fortsatt utfordrende og arbeidskrevende. For å akselerere denne prosessen utviklet laboratoriet vårt polytransfeksjon, en utvidelse med høy gjennomstrømning av tradisjonell pattedyrtransfeksjon. I polytransfeksjon utfører hver celle i den transfekterte populasjonen i hovedsak et annet eksperiment, tester oppførselen til kretsen ved forskjellige DNA-kopinumre og tillater brukere å analysere et stort antall støkiometrier i en enkeltpottreaksjon. Så langt har polytransfeksjoner som optimaliserer forholdet mellom trekomponentkretser i en enkelt brønn av celler blitt demonstrert; I prinsippet kan samme metode brukes til utvikling av enda større kretser. Poly-transfeksjonsresultater kan enkelt brukes for å finne optimale forhold mellom DNA og ko-transfeksjon for forbigående kretser eller for å velge ekspresjonsnivåer for kretskomponenter for generering av stabile cellelinjer.

Her demonstrerer vi bruken av poly-transfeksjon for å optimalisere en trekomponentkrets. Protokollen begynner med eksperimentelle designprinsipper og forklarer hvordan poly-transfeksjon bygger på tradisjonelle co-transfeksjonsmetoder. Deretter utføres polytransfeksjon av celler og etterfulgt av flowcytometri noen dager senere. Til slutt analyseres dataene ved å undersøke skiver av enkeltcellestrømningscytometridataene som tilsvarer delmengder av celler med visse komponentforhold. I laboratoriet har polytransfeksjon blitt brukt til å optimalisere celleklassifiserere, tilbakemeldings- og feedforward-kontrollere, bistabile motiver og mange flere. Denne enkle, men kraftige metoden fremskynder designsykluser for komplekse genetiske kretser i pattedyrceller.

Introduction

Feltet pattedyrs syntetiske biologi har raskt utviklet seg, fra å utvikle enkle sanse-og-respons-deler i dyrkede cellelinjer til optimalisering av komplekse nettverk av gener for å løse virkelige utfordringer innen diagnostikk og terapi¹. Disse sofistikerte kretsene er i stand til å registrere biologiske innganger fra mikroRNA-profiler til cytokiner til småmolekylære legemidler, og implementere logiske prosesseringskretser, inkludert transistorer, båndpassfiltre, vippebrytere og oscillatorer. De har også vist lovende resultater i dyremodeller av sykdommer som kreft, leddgikt, diabetes og mange flere 1,2,3,4,5. Men etter hvert som kompleksiteten til en krets vokser, blir optimalisering av nivåene til hver av komponentene stadig mer utfordrende.

En spesielt nyttig type genetisk krets er en celleklassifiserer, som kan programmeres til å fornemme og reagere på cellulære tilstander. Selektiv produksjon av protein- eller RNA-utganger i spesifikke cellulære tilstander er et kraftig verktøy for å veilede og programmere differensiering av celler og organoider, identifisere og ødelegge syke celler og / eller uønskede celletyper, og regulere funksjonen til terapeutiske celler 1,2,3,4,5 . Imidlertid har det vært svært utfordrende å skape kretser i pattedyrceller som nøyaktig kan klassifisere celletilstander fra flere cellulære RNA- og / eller proteinarter.

En av de mest tidkrevende trinnene for å utvikle en celleklassifiseringskrets er å optimalisere de relative uttrykksnivåene av individuelle komponentgener, for eksempel sensorer og prosesseringsfaktorer, i kretsen. For å øke hastigheten på kretsoptimalisering og tillate konstruksjon av mer sofistikerte kretser, har nylig arbeid brukt matematisk modellering av celleklassifiseringskretser og deres komponenter for å forutsi optimale sammensetninger og topologier ^6,7. Selv om dette har vist kraftige resultater så langt, er matematisk analyse begrenset av behovet for systematisk å karakterisere inngangsutgangsoppførselen til komponentgener i kretsen, noe som er tidkrevende. Videre kan et mylder av kontekstavhengige problemer dukke opp i komplekse genetiske kretser, noe som får oppførselen til en full krets til å trosse spådommer basert på individuelle delkarakteriseringer ^8,9.

For raskere å utvikle og teste komplekse pattedyrkretser som celletilstandsklassifiserere, utviklet laboratoriet vår en teknikk som kalles polytransfeksjon¹⁰, en utvikling av plasmid-ko-transfeksjonsprotokoller. Ved ko-transfeksjon kompleksiseres flere plasmid-DNA-arter sammen med et positivt ladet lipid- eller polymerreagens, og leveres deretter til celler på en korrelert måte (figur 1A). Ved polytransfeksjon kompleksiseres plasmider separat med reagenset, slik at DNA fra hvert transfeksjonskompleks leveres til celler på en dekorrelert måte (figur 1B). Ved hjelp av denne metoden blir celler i den transfekterte populasjonen utsatt for mange kombinasjoner av forhold mellom to eller flere DNA-nyttelaster som bærer forskjellige kretskomponenter.

For å måle forholdet mellom kretskomponenter levert til hver celle, inneholder hvert transfeksjonskompleks i en poly-transfeksjon en konstitutivt uttrykt fluorescerende reporter som tjener som en proxy for cellulær opptak av komplekset. Filler DNA som ikke inneholder noen elementer som er aktive i en pattedyrcelle, brukes til å justere den relative mengden av fluorescerende reporter og kretskomponenter levert til en celle i et enkelt transfeksjonskompleks og diskuteres mer detaljert i diskusjonen. Et eksempel på filler-DNA brukt i Weiss-laboratoriet er et plasmid som inneholder en terminatorsekvens, men ingen promotor, kodingssekvens, etc. Celler med forskjellige forhold mellom kretskomponenter kan deretter sammenlignes for å finne optimale forhold for genkretsfunksjon. Dette gir igjen nyttige prediksjoner for å velge promotorer og andre kretselementer for å oppnå optimale genuttrykksnivåer når man kombinerer kretskomponenter i en enkelt vektor for genetisk integrasjon (f.eks. Et lentivirus, transposon eller landingspute). I stedet for å velge forhold mellom kretskomponenter basert på intuisjon eller via en tidkrevende prøve- og feilprosess, evaluerer polytransfeksjon et bredt spekter av støkiometrier mellom genetiske deler i en enkeltpottreaksjon.

I vårt laboratorium har poly-transfeksjon muliggjort optimalisering av mange genetiske kretser, inkludert celleklassifiserere, tilbakemeldings- og feedforward-kontrollere og bistabile motiver. Denne enkle, men kraftige metoden øker designsyklusene betydelig for komplekse genetiske kretser i pattedyrceller. Poly-transfeksjon har siden blitt brukt til å karakterisere flere genetiske kretser for å avsløre deres flerdimensjonale inngangsutgangsoverføringsfunksjoner ved høy oppløsning 10, optimalisere en alternativ kretstopologi for celletilstandsklassifisering¹¹, og akselerere ulike publiserte^12,13 og pågående prosjekter.

Her beskriver og skildrer vi arbeidsflyten for bruk av polytransfeksjon for raskt å optimalisere en genetisk krets (figur 2). Protokollen viser hvordan man genererer polytransfeksjonsdata av høy kvalitet og unngår flere vanlige feil i polytransfeksjonsprotokollen og dataanalysen (figur 3). Den demonstrerer deretter hvordan man bruker poly-transfeksjon for å karakterisere enkle kretskomponenter og i prosessen benchmark poly-transfeksjonsresultater mot ko-transfeksjon (figur 4). Endelig viser resultatene av polytransfeksjon optimalisering av kreftklassifiseringskretsen (figur 5).

Protocol

MERK: Tabell 1 og tabell 2 tjener som viktige referanser for denne protokollen. Tabell 1 viser reagensskalering for reaksjoner, og tabell 2 viser DNA-ratioaritmetikk for et eksempel polytransfeksjon beskrevet i protokollen (øvre halvdel) og for et mulig oppfølgingseksperiment (nedre halvdel). 1. Forbereder celler for transfeksjon Sørg for at kulturen til humane embryonale nyreceller (HEK293) er 60…

Representative Results

I figur 1 sammenligner vi ko-transfeksjon med poly-transfeksjon. I en ko-transfeksjon leveres alle plasmider i samme transfeksjonsblanding, noe som resulterer i høy korrelasjon mellom mengden av hvert plasmid en enkelt celle mottar (figur 1A). Mens antall totale plasmider levert til hver celle varierer betydelig, er fluorescensen av de to reporterproteinene i de enkelte cellene over hele befolkningen godt korrelert, noe som indikerer at de to plasmidene blir le…

Discussion

Raske prototypingsmetoder som dataassistert design (CAD), breadboarding og 3D-utskrift har revolusjonert mekaniske, elektriske og siviltekniske disipliner. Evnen til raskt å søke gjennom mange mulige løsninger på en gitt utfordring akselererer i stor grad fremgang i et felt. Vi tror at poly-transfeksjon er en analog teknologi for biologisk engineering, som muliggjør rask prototyping av genetiske kretser. I tillegg krever andre raske prototypingsteknologier praktisk sekvensiell iterasjon av flere mulige løsninger, m…

Materials

15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI