Snabb utveckling av celltillståndsidentifieringskretsar med polytransfektion

Summary

Komplexa genetiska kretsar är tidskrävande att designa, testa och optimera. För att underlätta denna process transfekteras däggdjursceller på ett sätt som möjliggör testning av flera stökiometrier av kretskomponenter i en enda brunn. Detta protokoll beskriver stegen för experimentell planering, transfektion och dataanalys.

Abstract

Däggdjurs genetiska kretsar har visat potentialen att känna av och behandla ett brett spektrum av sjukdomstillstånd, men optimering av nivåerna av kretskomponenter är fortfarande utmanande och arbetsintensiv. För att påskynda denna process utvecklade vårt laboratorium polytransfektion, en förlängning med hög genomströmning av traditionell däggdjurstransfektion. Vid polytransfektion utför varje cell i den transfekterade populationen i huvudsak ett annat experiment, testar kretsens beteende vid olika DNA-kopieringsnummer och tillåter användare att analysera ett stort antal stökiometrier i en enkelpottreaktion. Hittills har polytransfektioner som optimerar förhållandena för trekomponentkretsar i en enda brunn av celler visats; I princip kan samma metod användas för utveckling av ännu större kretsar. Polytransfektionsresultat kan enkelt tillämpas för att hitta optimala förhållanden mellan DNA och samtransfekt för transienta kretsar eller för att välja uttrycksnivåer för kretskomponenter för generering av stabila cellinjer.

Här demonstrerar vi användningen av polytransfektion för att optimera en trekomponentkrets. Protokollet börjar med experimentella designprinciper och förklarar hur polytransfektion bygger på traditionella samtransfektionsmetoder. Därefter utförs polytransfektion av celler och följs av flödescytometri några dagar senare. Slutligen analyseras data genom att undersöka skivor av encellsflödescytometridata som motsvarar delmängder av celler med vissa komponentförhållanden. I labbet har polytransfektion använts för att optimera cellklassificerare, återkopplings- och feedforward-kontroller, bistabila motiv och många fler. Denna enkla men kraftfulla metod påskyndar designcykler för komplexa genetiska kretsar i däggdjursceller.

Introduction

Området syntetisk biologi hos däggdjur har snabbt utvecklats, från att utveckla enkla sense-and-respond-delar i odlade cellinjer till optimering av komplexa nätverk av gener för att ta itu med verkliga utmaningar inom diagnostik och terapi¹. Dessa sofistikerade kretsar kan känna av biologiska ingångar från mikroRNA-profiler till cytokiner till småmolekylära läkemedel och implementera logiska bearbetningskretsar inklusive transistorer, bandpassfilter, vippomkopplare och oscillatorer. De har också visat lovande resultat i djurmodeller av sjukdomar som cancer, artrit, diabetes och många fler 1,2,3,4,5. Men när komplexiteten hos en krets växer blir optimering av nivåerna för var och en av dess komponenter alltmer utmanande.

En särskilt användbar typ av genetisk krets är en cellklassificerare, som kan programmeras för att känna av och svara på cellulära tillstånd. Selektiv produktion av protein- eller RNA-utgångar i specifika cellulära tillstånd är ett kraftfullt verktyg för att styra och programmera differentiering av celler och organoider, identifiera och förstöra sjuka celler och / eller oönskade celltyper och reglera funktionen hos terapeutiska celler 1,2,3,4,5 . Att skapa kretsar i däggdjursceller som exakt kan klassificera celltillstånd från flera cellulära RNA och / eller proteinarter har dock varit mycket utmanande.

Ett av de mest tidskrävande stegen för att utveckla en cellklassificeringskrets är att optimera de relativa uttrycksnivåerna för enskilda komponentgener, såsom sensorer och bearbetningsfaktorer, inom kretsen. För att påskynda kretsoptimering och möjliggöra konstruktion av mer sofistikerade kretsar har nyligen arbete använt matematisk modellering av cellklassificerarkretsar och deras komponenter för att förutsäga optimala kompositioner och topologier ^6,7. Även om detta hittills har visat kraftfulla resultat, begränsas matematisk analys av behovet av att systematiskt karakterisera input-output-beteendet hos komponentgener i kretsen, vilket är tidskrävande. Vidare kan en myriad av kontextberoende problem uppstå i komplexa genetiska kretsar, vilket gör att beteendet hos en hel krets trotsar förutsägelser baserade på enskilda delkarakteriseringar ^8,9.

För att snabbare utveckla och testa komplexa däggdjurskretsar som celltillståndsklassificerare utvecklade vårt laboratorium en teknik som kallas polytransfektion¹⁰, en utveckling av plasmid-samtransfektionsprotokoll. Vid samtransfektion komplexiseras flera plasmid-DNA-arter tillsammans med ett positivt laddat lipid- eller polymerreagens och levereras sedan till celler på ett korrelerat sätt (figur 1A). Vid polytransfektion komplexiseras plasmider separat med reagenset, så att DNA från varje transfektionskomplex levereras till celler på ett dekorrelerat sätt (figur 1B). Med hjälp av denna metod utsätts celler inom den transfekterade populationen för många kombinationer av förhållanden mellan två eller flera DNA-nyttolaster som bär olika kretskomponenter.

För att mäta förhållandena mellan kretskomponenter som levereras till varje cell innehåller varje transfektionskomplex inom en polytransfektion en konstitutivt uttryckt fluorescerande reporter som fungerar som en proxy för cellulärt upptag av komplexet. Filler-DNA som inte innehåller några element som är aktiva i en däggdjurscell används för att ställa in den relativa mängden fluorescerande reporter och kretskomponenter som levereras till en cell i ett enda transfektionskomplex och diskuteras mer detaljerat i diskussionen. Ett exempel på fyllnads-DNA som används i Weiss-laboratoriet är en plasmid som innehåller en terminatorsekvens, men ingen promotorisk, kodande sekvens etc. Celler med olika förhållanden av kretskomponenter kan sedan jämföras för att hitta optimala förhållanden för genkretsfunktion. Detta ger i sin tur användbara förutsägelser för att välja promotorer och andra kretselement för att uppnå optimala genuttrycksnivåer när man kombinerar kretskomponenter till en enda vektor för genetisk integration (t.ex. ett lentivirus, transposon eller landningsplatta). Således, istället för att välja förhållanden mellan kretskomponenter baserat på intuition eller via en tidskrävande försök och felprocess, utvärderar polytransfektion ett brett spektrum av stökiometrier mellan genetiska delar i en enkelpottreaktion.

I vårt laboratorium har polytransfektion möjliggjort optimering av många genetiska kretsar, inklusive cellklassificerare, återkopplings- och feedforward-kontroller och bistabila motiv. Denna enkla men kraftfulla metod påskyndar avsevärt designcykler för komplexa genetiska kretsar i däggdjursceller. Polytransfektion har sedan dess använts för att karakterisera flera genetiska kretsar för att avslöja deras flerdimensionella input-output-överföringsfunktioner vid hög upplösning¹⁰, optimera en alternativ kretstopologi för celltillståndsklassificering 11 och påskynda olika publicerade^12,13 och pågående projekt.

Här beskriver och skildrar vi arbetsflödet för att använda polytransfektion för att snabbt optimera en genetisk krets (Figur 2). Protokollet visar hur man genererar högkvalitativa polytransfektionsdata och undviker flera vanliga fel i polytransfektionsprotokollet och dataanalysen (figur 3). Den visar sedan hur man använder polytransfektion för att karakterisera enkla kretskomponenter och, i processen, jämföra polytransfektionsresultat mot samtransfektion (figur 4). Slutligen visar resultaten av polytransfektion optimering av cancerklassificeringskretsen (figur 5).

Protocol

OBS: Tabell 1 och tabell 2 tjänar som viktiga referenser för detta protokoll. Tabell 1 visar reagensskalning för reaktioner, och tabell 2 visar DNA-kvot aritmetik för ett exempel på polytransfektion som beskrivs i protokollet (övre halvan) och för ett eventuellt uppföljningsexperiment (nedre halvan). 1. Förbereda celler för transfektion Se till att kulturen av humana embryonala njurceller (…

Representative Results

I figur 1 jämför vi samtransfektion med polytransfektion. I en samtransfektion levereras alla plasmider i samma transfektionsblandning, vilket resulterar i hög korrelation mellan mängden av varje plasmid som en enskild cell tar emot (figur 1A). Medan antalet totala plasmider som levereras till varje cell varierar avsevärt, är fluorescensen hos de två rapportproteinerna i de enskilda cellerna över hela befolkningen väl korrelerad, vilket indikerar att de…

Discussion

Snabba prototypmetoder som datorstödd design (CAD), breadboarding och 3D-utskrift har revolutionerat mekaniska, elektriska och civilingenjörsdiscipliner. Möjligheten att snabbt söka igenom många möjliga lösningar på en given utmaning påskyndar kraftigt framstegen inom ett område. Vi tror att polytransfektion är en analog teknik för bioteknik, vilket möjliggör snabb prototypning av genetiska kretsar. Dessutom kräver andra snabba prototyptekniker praktisk sekventiell iteration av flera möjliga lösningar, m…

Materials

15mL Corning Falcon conical tubes	ThermoFisher Scientific	14-959-53A
24-well petri dish	Any company of choice		(Non-pyrogenic, Sterile, RNase, DNase, DNA and Pyrogen Free)
Bovine serum albumin	NEB	B9000S
Centrifuge	Any company of choice		Capable of exposing 15mL Falcon tubes to 300 rcf
Countess 3 Automated Cell Counter	ThermoFisher Scientific	AMQAX2000
Countess Cell Counting Chamber Slides	ThermoFisher Scientific	C10228
Cytoflow	Non-commercial software package		https://cytoflow.readthedocs.io/en/stable/#
DMEM	VWR	10-013-CV	Use the correct media for your cell type
EDTA	ThermoFisher Scientific	03690-100ML
Fetal bovine serum	Sigma Aldrich	F4135
HEK cells	ATCC	CRL-1573	Use the relevant cell type for your experiments. HEK cells tend to transfect very efficiently.
HeLa cells	ATCC	CRL-12401	Use the relevant cell type for your experiments.
Lipofectamine 3000 and P3000 enhancer	ThermoFisher Scientific	L3000001	Use the correct reagent for your cell type; transfection and enhancer reagent
LSRFortessa flow cytometer	BD Biosciences	N/A
MEM Non-Essential Amino Acids Solution	Gibco	11140050
Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL	Any company of choice
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	31985070	reduced serum medium
Phosphate buffered saline	ThermoFisher Scientific	70011044
Rainbow calibration beads	Spherotech	URCP-100-2H
Sodium azide	Sigma Aldrich	S2002
Trypsin	VWR	25-053-CI