Isolamento non acquoso e arricchimento di tricomi ghiandolari e sessili da Cannabis sativa
Summary
Viene presentato un protocollo per l’isolamento e l’arricchimento conveniente e ad alto rendimento dei tricomi ghiandolari e sessili da Cannabis sativa. Il protocollo si basa su un’estrazione secca e non tampone di tricomi utilizzando solo azoto liquido, ghiaccio secco e setacci di nylon ed è adatto per l’estrazione dell’RNA e l’analisi trascrittomica.
Abstract
Questo articolo presenta un protocollo per l’isolamento e l’arricchimento conveniente e ad alto rendimento dei tricomi ghiandolari capitati e sessili da Cannabis sativa. Le vie biosintetiche per il metabolismo dei cannabinoidi e dei terpeni volatili sono localizzate principalmente nei tricomi della cannabis e i tricomi isolati sono utili per l’analisi del trascrittoma. I protocolli esistenti per isolare i tricomi ghiandolari per la caratterizzazione trascrittomica sono scomodi e forniscono teste di tricoma compromesse e una quantità relativamente bassa di tricomi isolati. Inoltre, si basano su costosi apparati e mezzi di isolamento contenenti inibitori proteici per evitare la degradazione dell’RNA. Il presente protocollo suggerisce di combinare tre singole modifiche per ottenere una grande quantità di dimostri ghiandolari isolati e tricomi sessili rispettivamente dalle infiorescenze femminili mature e dalle foglie a ventaglio di C. sativa. La prima modifica prevede la sostituzione dell’azoto liquido per il mezzo di isolamento convenzionale per facilitare il passaggio dei tricomi attraverso i microsetacci. La seconda modifica prevede l’uso di ghiaccio secco per staccare i tricomi dalla fonte vegetale. La terza modifica prevede il passaggio consecutivo del materiale vegetale attraverso cinque micro-setacci di dimensioni dei pori decrescenti. L’imaging microscopico ha dimostrato l’efficacia della tecnica di isolamento per entrambi i tipi di tricomi. Inoltre, la qualità dell’RNA estratto dai tricomi isolati era appropriata per l’analisi trascrittomica a valle.
Introduction
I tricomi ghiandolari sono strutture simili a capelli presenti nelle piante che contengono molti metaboliti secondari1 e rappresentano una preziosa banca di nuovi geni ed enzimi biosintetici2. Nella Cannabis, la biosintesi degli importanti metaboliti secondari, cannabinoidi3 e terpeni4, è localizzata nei tricomi. Considerando il ruolo dei tricomi nel determinare la qualità della cannabis sia per usi medicinali che ricreativi, lo studio dell’espressione genica dei tricomi è interessante. Per caratterizzare l’espressione di geni specifici del tricomi, i tricomi di interesse devono prima essere isolati. I protocolli di isolamento dei tricomi sono stati descritti per la prima volta già nel 19925 e i loro ultimi sviluppi sono stati recentemente rivisti2. In generale, i protocolli per l’estrazione dei tricomi ghiandolari per la caratterizzazione trascrittomica possono essere suddivisi in due fasi sequenziali distinte. Il primo passo prevede un’accurata separazione fisica dei tricomi dal tessuto vegetale. Questo passaggio può essere eseguito utilizzando ghiaccio secco5, perle di vetro con un apparato commerciale6,7, macinando il materiale vegetale contro un setaccio a maglie8 o vorticando il tessuto vegetale in un tampone di isolamento9. La seconda fase prevede una separazione più raffinata dei tricomi di interesse dal residuo vegetale microscopico e / o da altri tipi di tricomi. Questo passaggio può essere eseguito utilizzando centrifugazione a gradiente di densità 8,10 o setacci di varie dimensioni 7,9. A causa dell’estrema sensibilità dell’RNA nei tessuti trasformati agli agenti degradanti, queste due fasi sequenziali sono solitamente condotte nel mezzo di isolamento ghiacciato, spesso in presenza di inibitori proteici4.
I protocolli convenzionali di isolamento dei tricomi richiedono, oltre alle temperature gelide, grandi quantità di mezzo di isolamento per garantire una procedura di estrazione efficiente. La combinazione di questi componenti si traduce in un processo di isolamento arduo e dispendioso in termini di tempo che ostacola l’elevata produttività. Presentare un protocollo alternativo di isolamento dei tricomi semplice e intuitivo è, quindi, probabile che sia utile per vari aspetti associati alla caratterizzazione dei tricomi. Il presente articolo mira a offrire un protocollo alternativo per isolare i tricomi ghiandolari peduncolari e sessili dalla Cannabis sativa combinando e integrando diversi elementi dei protocolli convenzionali. Questi elementi includono il ghiaccio secco5, il passaggio dei tricomi attraverso diversi micro-setacci con dimensioni dei pori decrescenti 7,9 e la sostituzione dell’azoto liquido (LN) per il mezzo di isolamento8.
La novità dell’attuale protocollo di isolamento dei tricomi, rispetto ai protocolli convenzionali, si presenta in diversi modi. Questo protocollo è conveniente, in quanto non richiede componenti pericolosi. La procedura può essere condotta in laboratorio con precauzioni minime e facilita l’elevata produttività. La sostituzione di LN per il mezzo di isolamento liquido standard garantisce l’integrità dei tricomi durante tutto il processo di isolamento, consentendo una successiva analisi trascrittomica. Dopo la sublimazione del LN e del ghiaccio secco, i tricomi isolati vengono lasciati liberi da residui nocivi. Inoltre, la propensione di LN a sublimare a temperatura ambiente ne consente l’uso generoso in tutto il protocollo. Al contrario, l’utilizzo di grandi volumi di mezzi di isolamento convenzionali genera difficoltà pratiche nella sua gestione. Infine, il protocollo riduce la separazione della cellula del disco dalla restante fragile struttura della testa del tricoma ghiandolare, consentendo la conservazione del contenuto dello spazio di testa.
Questo protocollo è presentato in modo dettagliato passo-passo progettato per aiutare la pratica tecnica di isolamento dei tricomi capitati ghiandolari di C. sativa. Il protocollo fornisce un flusso di lavoro gestibile che si traduce in tricomi isolati con un’alta concentrazione e purezza che sono appropriati per l’analisi molecolare a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
Rispetto ai protocolli di isolamento tricomico attualmente disponibili, due modifiche principali sono descritte nel presente protocollo. Questi includono il distacco dei tricomi dal materiale vegetale utilizzando ghiaccio secco nella fase iniziale e la sostituzione di LN per il mezzo tampone liquido comunemente usato. La prima modifica per la purificazione dei tricomi di C. sativa si basa su un protocollo precedente che ha introdotto l’uso di ghiaccio secco tritato per staccare i tricomi dai pedicelli di geranio…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori riconoscono il sostegno finanziario di CannabiVar Ltd. Tutto il materiale vegetale è stato generosamente fornito dal professor Hinanit Koltai del Volcani Center, Israele.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
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