Ikke-vandig isolasjon og anrikning av kjertelkapitat stilket og sessile trichomes fra Cannabis sativa
Summary
En protokoll presenteres for praktisk og høy gjennomstrømningsisolasjon og anrikning av kjertelkapitat, stilkede og sessile trikomer fra Cannabis sativa. Protokollen er basert på en tørr, ikke-bufferekstraksjon av trikomer ved bruk av bare flytende nitrogen, tørris og nylonsikt og er egnet for RNA-ekstraksjon og transkriptomisk analyse.
Abstract
Dette papiret presenterer en protokoll for praktisk og høy gjennomstrømningsisolasjon og anrikning av kjertelkapitat stilket og sessile trichomes fra Cannabis sativa. De biosyntetiske veiene for cannabinoid og flyktig terpenmetabolisme er lokalisert primært i cannabistrikomer , og isolerte trikomer er gunstige for transkriptomanalyse. De eksisterende protokollene for isolering av kjerteltrikomer for transkriptomisk karakterisering er ubeleilige og leverer kompromitterte trikomhoder og en relativt lav mengde isolerte trikomer. Videre er de avhengige av dyre apparater og isolasjonsmedier som inneholder proteinhemmere for å unngå RNA-nedbrytning. Den nåværende protokollen foreslår å kombinere tre individuelle modifikasjoner for å oppnå en stor mengde isolert glandular capitate stilket og sessile trichomes fra C. sativa modne kvinnelige blomsterstander og vifteblader, henholdsvis. Den første modifikasjonen innebærer å erstatte flytende nitrogen for det konvensjonelle isolasjonsmediet for å lette passasjen av trikomer gjennom mikrosiktene. Den andre modifikasjonen innebærer bruk av tørris for å løsne trikomene fra plantekilden. Den tredje modifikasjonen innebærer å føre plantematerialet fortløpende gjennom fem mikrosiler med avtagende porestørrelser. Mikroskopisk avbildning demonstrerte effektiviteten av isolasjonsteknikken for begge trichometyper. I tillegg var kvaliteten på RNA ekstrahert fra de isolerte trikomene passende for nedstrøms transkriptomisk analyse.
Introduction
Glandulære trikomer er hårlignende strukturer som finnes i planter som inneholder mange sekundære metabolitter1 og representerer en verdifull bank med nye biosyntetiske gener og enzymer2. I cannabis er biosyntesen av de viktige sekundære metabolittene, cannabinoider3 og terpener4, lokalisert i trikomene. Tatt i betraktning trikomenes rolle i å bestemme kvaliteten på cannabis både for medisinsk og rekreasjonsbruk, er studien av trichome-genuttrykk av interesse. For å karakterisere uttrykket av trichome-spesifikke gener, må trikomene av interesse først isoleres. Trichomes isolasjonsprotokoller ble først beskrevet så tidlig som i 19925, og deres siste utvikling har nylig blitt gjennomgått2. Generelt kan protokoller for ekstrahering av kjerteltrikomer for transkriptomisk karakterisering deles inn i to forskjellige sekvensielle trinn. Det første trinnet innebærer en grundig fysisk separasjon av trikomene fra plantevevet. Dette trinnet kan utføres ved å bruke tørris5, glassperler med et kommersielt apparat6,7, slipe plantematerialet mot en maskesikt8, eller vortexing av plantevevet i en isolasjonsbuffer9. Det andre trinnet innebærer en mer raffinert separasjon av trikomene av interesse fra de mikroskopiske planterester og / eller andre trichome-typer. Dette trinnet kan utføres ved hjelp av tetthetsgradientsentrifugering 8,10 eller sikter i forskjellige størrelser 7,9. På grunn av den ekstreme følsomheten av RNA i bearbeidet vev til nedbrytningsmidler, utføres disse to sekvensielle trinnene vanligvis i det iskalde isolasjonsmediet, ofte i nærvær av proteinhemmere4.
Konvensjonelle trikomisolasjonsprotokoller krever, i tillegg til de iskalde temperaturene, store mengder isolasjonsmedium for å sikre en effektiv ekstraksjonsprosedyre. Kombinasjonen av disse komponentene resulterer i en vanskelig, tidkrevende isolasjonsprosess som hindrer høy gjennomstrømning. Å presentere en enkel, brukervennlig alternativ trichome-isolasjonsprotokoll vil derfor sannsynligvis være gunstig for ulike aspekter forbundet med trichome-karakterisering. Denne artikkelen tar sikte på å tilby en alternativ protokoll for isolering av stilkede og fastsittende kjertelkapitulatoriske trikomer fra Cannabis sativa ved å kombinere og integrere flere elementer fra de konvensjonelle protokollene. Disse elementene inkluderer tørris5, passering av trikomene gjennom flere mikrosikter med avtagende porestørrelser7,9, og erstatning av flytende nitrogen (LN) for isolasjonsmediet8.
Nyheten i den nåværende trichome-isolasjonsprotokollen, sammenlignet med konvensjonelle protokoller, presenterer på en rekke måter. Denne protokollen er praktisk, da den ikke krever farlige komponenter. Prosedyren kan utføres i laboratoriet med minimale forholdsregler og letter høy gjennomstrømning. Erstatning av LN for standard væskeisolasjonsmedium sikrer trikomenes integritet gjennom hele isolasjonsprosessen, noe som muliggjør påfølgende transkriptomisk analyse. Ved sublimering av LN og tørris blir de isolerte trikomene igjen fri for skadelige rester. Videre tillater LNs tilbøyelighet til å sublimere ved romtemperatur sin sjenerøse bruk gjennom hele protokollen. I motsetning til dette genererer bruk av store mengder konvensjonelt isolasjonsmedium praktiske vanskeligheter i håndteringen. Til slutt reduserer protokollen separasjonen av skivecellen fra den gjenværende skjøre hodestrukturen til kjerteltrikomen, noe som muliggjør oppbevaring av headspace-innholdet.
Denne protokollen presenteres på en detaljert trinnvis måte designet for å hjelpe den tekniske praksisen med å isolere C. sativa glandular capitate trichomes. Protokollen gir en håndterbar arbeidsflyt som resulterer i isolerte trikomer med høy konsentrasjon og renhet som passer for nedstrøms molekylær analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammenlignet med de nåværende tilgjengelige trichome-isolasjonsprotokollene, er to hovedmodifikasjoner beskrevet i denne protokollen. Disse inkluderer løsrivelse av trikomene fra plantematerialet ved bruk av tørris i det første trinnet og erstatning av LN for det vanlige flytende buffermediet. Den første modifikasjonen for C. sativa trichome-rensing er basert på en tidligere protokoll som introduserte bruk av knust tørris for å løsne trikomene fra geraniumpedikler5. Mens tradisj…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne erkjenner økonomisk støtte fra CannabiVar Ltd. Alt plantemateriale ble sjenerøst levert av professor Hinanit Koltai fra Volcani Center, Israel.
Materials
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
