Studiare gli effetti epiteliali dell'infiammazione intestinale in vitro su colonoidi murini accertati
Summary
Descriviamo un protocollo che descrive in dettaglio l’isolamento delle cripte del colon murino per lo sviluppo di colonoidi tridimensionali. I colonoidi stabiliti possono quindi essere differenziati terminalmente per riflettere la composizione cellulare dell’epitelio ospite prima di ricevere una sfida infiammatoria o di essere diretti a stabilire un monostrato epiteliale.
Abstract
L’epitelio intestinale svolge un ruolo essenziale nella salute umana, fornendo una barriera tra l’ospite e l’ambiente esterno. Questo strato cellulare altamente dinamico fornisce la prima linea di difesa tra popolazioni microbiche e immunitarie e aiuta a modulare la risposta immunitaria intestinale. La rottura della barriera epiteliale è un segno distintivo della malattia infiammatoria intestinale (IBD) ed è di interesse per il targeting terapeutico. Il sistema di coltura di colonoidi tridimensionali è un modello in vitro estremamente utile per lo studio della dinamica delle cellule staminali intestinali e della fisiologia delle cellule epiteliali nella patogenesi delle IBD. Idealmente, stabilire colonoidi dal tessuto epiteliale infiammato degli animali sarebbe più utile per valutare le influenze genetiche e molecolari sulla malattia. Tuttavia, abbiamo dimostrato che i cambiamenti epiteliali in vivo non sono necessariamente mantenuti nei colonoidi stabiliti da topi con infiammazione acuta. Per affrontare questa limitazione, abbiamo sviluppato un protocollo per trattare i colonoidi con un cocktail di mediatori infiammatori che sono tipicamente elevati durante l’IBD. Mentre questo sistema può essere applicato ovunque a varie condizioni di coltura, questo protocollo enfatizza il trattamento sia su colonoidi differenziati che su monostrati 2-dimensionali derivati da colonoidi stabiliti. In un ambiente di coltura tradizionale, i colonoidi sono arricchiti con cellule staminali intestinali, fornendo un ambiente ideale per studiare la nicchia delle cellule staminali. Tuttavia, questo sistema non consente un’analisi delle caratteristiche della fisiologia intestinale, come la funzione di barriera. Inoltre, i colonoidi tradizionali non offrono l’opportunità di studiare la risposta cellulare delle cellule epiteliali terminalmente differenziate agli stimoli proinfiammatori. I metodi qui presentati forniscono un quadro sperimentale alternativo per affrontare queste limitazioni. Il sistema di coltura monostrato 2-dimensionale offre anche un’opportunità per lo screening terapeutico dei farmaci ex vivo. Questo strato polarizzato di cellule può essere trattato con mediatori infiammatori sul lato basale della cellula e in concomitanza con terapie putative apicalmente per determinare la loro utilità nel trattamento dell’IBD.
Introduction
La malattia infiammatoria intestinale (IBD) è una malattia cronica, remittente e recidivante caratterizzata da episodi di infiammazione e quiescenza clinica. L’eziologia dell’IBD è multifattoriale, ma le caratteristiche chiave della malattia includono la funzione barriera difettosa e l’aumento della permeabilità dell’epitelio intestinale, oltre alle cascate di segnalazione proinfiammatoria attivate all’interno del compartimento epiteliale 1,2. Diversi modelli in vitro e in vivo sono stati utilizzati per ricapitolare la risposta epiteliale durante l’IBD, compresi i modelli di coltura cellulare e murino di infiammazione3. Tuttavia, tutti questi sistemi hanno importanti carenze che limitano la loro capacità di ricapitolare i cambiamenti epiteliali durante IBD4. La maggior parte delle linee cellulari utilizzate per studiare l’IBD sono trasformate, hanno la capacità di formare un monostrato e possono differenziare3 ma propagarsi intrinsecamente in modo diverso rispetto alle cellule epiteliali intestinali non trasformate nell’ospite. Diversi modelli murini di infiammazione sono utilizzati per studiare IBD, alcuni dei quali includono modelli knockout, modelli infettivi, modelli infiammatori chimici e modelli di trasferimento delle cellule T 5,6,7,8. Mentre ognuno può studiare alcuni aspetti eziologici dell’IBD, come le predisposizioni genetiche, la disfunzione della barriera, la deregolazione immunitaria e il microbioma, sono limitati nella loro capacità di studiare la natura multifattoriale della malattia.
Gli organoidi intestinali, inclusi enteroidi e colonoidi, sono stati affermati nell’ultimo decennio come un utile modello in vitro per studiare non solo la dinamica delle cellule staminali intestinali, ma anche il loro ruolo che l’integrità della barriera e la funzione dell’epitelio intestinale svolgono nell’omeostasi e nella malattia intestinale. Queste entità hanno contribuito in modo significativo alla nostra comprensione della patogenesi di IBD9 e hanno aperto nuove opportunità per la medicina personalizzata. I colonoidi, o colture tissutali auto-organizzanti derivate da cellule staminali dal colon, sono stati sviluppati sia da tessuto murino che umano in un processo che consente alle cellule staminali situate all’interno delle cripte intestinali di propagarsi e mantenersi indefinitamente10. La nicchia delle cellule staminali in vivo si basa su fattori extracellulari per sostenere la sua crescita, in particolare le vie canoniche di segnalazione Wnt e di segnalazione delle proteine morfogeniche ossee11. L’aggiunta di questi fattori promuove la salute e la longevità dei colonoidi, ma spinge anche la coltura verso uno stato simile alle cellule staminali che non riflette l’architettura cellulare epiteliale in vivo, che consiste sia di cellule auto-rinnovanti che di cellule terminalmente differenziate12,13. Mentre la funzionalità dell’epitelio intestinale dipende dalla continua diafonia tra il compartimento delle cellule staminali e le cellule differenziate, la capacità di avere entrambi in un sistema di coltura di colonoidi è piuttosto limitata. Nonostante queste limitazioni, il sistema di coltura organoide rimane il gold standard per studiare le proprietà intrinseche dell’epitelio ex vivo. Tuttavia, potrebbe essere necessario prendere in considerazione strategie culturali alternative per rispondere alla domanda scientifica in questione.
È stato dimostrato che i topi con un regime continuo di 7 giorni di destrano solfato di sodio (DSS) sviluppano sia infiammazione epiteliale che disfunzione barriera14. Inoltre, il fallimento della biogenesi mitocondriale e la riprogrammazione metabolica all’interno dell’epitelio intestinale, che hanno dimostrato di essere evidenti nell’IBD umana, sono stati catturati anche in questo modello DSS di colite15. Tuttavia, i nostri dati preliminari dimostrano che le caratteristiche del fallimento della biogenesi mitocondriale non sono mantenute nei colonoidi derivati dalle cripte di animali trattati con DSS (Figura supplementare 1). Pertanto, i metodi di coltura alternativi devono essere utilizzati quando si esamina come l’infiammazione guida i cambiamenti epiteliali durante l’infiammazione intestinale murina. Qui, delineiamo un protocollo che abbiamo sviluppato che descrive 1) come isolare le cripte dall’intero tessuto del colon per la creazione di colonoidi murini, 2) come differenziare terminalmente questa popolazione cellulare per riflettere la popolazione cellulare così com’è in vivo e 3) come indurre l’infiammazione in questo modello in vitro . Per studiare le interazioni farmacologiche all’interno dell’epitelio infiammato, abbiamo sviluppato un protocollo per stabilire monostrati 2-dimensionali (2D) da colonoidi murini che possono essere trattati basalmente con mediatori infiammatori e trattati apicamente con terapie farmacologiche.
Protocol
Representative Results
Discussion
Lo sviluppo di organoidi ha rivoluzionato il modo in cui la comunità scientifica studia i sistemi di organi in vitro con la capacità di ricapitolare parzialmente la struttura e la funzione cellulare di un animale o di un essere umano in un piatto. Inoltre, i sistemi organoidi derivati da esseri umani con malattie offrono uno strumento promettente per la medicina personalizzata che potrebbe guidare il processo decisionale terapeutico. Qui, descriviamo un protocollo di isolamento della cripta che funziona bene e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants R01DK120986 (a K.P.M.).
Materials
| 0.4-μM transparent transwell, 24-well | Greiner Bio-one | 662-641 | |
| 15-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-269 | |
| 50-mL conical tubes | Thermo Fisher | 12-565-271 | |
| 70-μM cell strainer | VWR | 76327-100 | |
| Advanced DMEM/F12 | Invitrogen | 12634-010 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| B-27 supplement | Invitrogen | 12587-010 | Stock Concentration (50x); Final Concentration (1x) |
| Chopsticks Electrode Set for EVO | World Precision Instruments | STX2 | |
| Corning Matrigel GFR Membrane Mix | Corning | 354-230 | Stock Concentration (100%); Final Concentration (100%) |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | D0632-5G | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (1.5 mM); Solvent (ultrapure water) |
| DMEM high glucose | Thermo Fisher | 11960-069 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline without Calcium and Magnesium | Gibco | 14190-144 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (ETDA) | Sigma-Aldrich | E7889 | Stock Concentration (0.5 M); Final Concentration (30 mM) |
| Fetal Bovine Serum | Bio-Techne | S11150H | Stock Concentration (100%); Final Concentration (1%) |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides, White, 25 x 75 mm | Thermo Fisher | 12-550-15 | |
| G418 | InvivoGen | ant-ga-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| Gentamicin Reagent | Gibco/Fisher | 15750-060 | Stock Concentration (50 mg/mL); Final Concentration (250 μg/mL) |
| GlutaMAX-1 | Fisher Scientific | 35050-061 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| HEPES 1 M | Gibco | 15630-080 | Stock Concentration (1 M); Final Concentration (10 mM) |
| hIFNγ | R&D Systems | 285-IF | Stock Concentration (1000 ng/µL); Final Concentration (10 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hIL-1β | R&D Systems | 201-LB | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (20 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| hTNFα | R&D Systems | 210-TA | Stock Concentration (10 ng/µL); Final Concentration (40 ng/mL); Solvent (ultrapure water) |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009 | Stock Concentration (30%); Final Concentration (0.003%); Solvent (Mouse wash media) |
| Hygromycin B Gold | InvivoGen | ant-hg-1 | Final Concentration (400 µg/µL) |
| L-WRN Cell Line | ATCC | CRL-3276 | |
| mEGF | Novus | NBP2-35176 | Stock Concentration (0.5 µg/µL); Final Concentration (50 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-5G | Stock Concentration (500 mM); Final Concentration (1 mM); Solvent (ultrapure water) |
| Noggin | Peprotech | 250-38 | Stock Concentration (0.1 ng/µL); Final Concentration (100 ng/mL); Solvent (UltraPure water + 0.1% BSA) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher | 15140-122 | Stock Concentration (100x); Final Concentration (1x) |
| Petri dishes (sterilized; 100 mm x 15 mm) Polystrene disposable | VWR | 25384-342 | |
| Polystyrene Microplates, 24 well tissue culture treated, sterile | Greiner Bio-one | 5666-2160 | |
| R-Spondin | R&D Systems | 3474-RS-050 | Stock Concentration (0.25 µg/µL); Final Concentration (500 ng/mL); Solvent (D-PBS + 1% BSA) |
| Tryp LE Express | Thermo Fisher | 12604-013 | Stock Concentration (10x); Final Concentration (1x); Solvent (1 mM EDTA) |
| UltraPure Water | Invitrogen | 10977-023 | Stock Concentration (1x); Final Concentration (1x) |
| Y-27632 dihyddrochloride | Abcam | ab120129 | Stock Concentration (10 mM); Final Concentration (10 µM); Solvent (UltraPure Water) |
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