JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Spänningsberoende kaliumströmregistrering på H9C2-kardiomyocyter via helcellspatchklämtekniken

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Detta protokoll beskriver en effektiv metod för realtids- och dynamisk förvärv av spänningsstyrda kalium (Kv) kanalströmmar i H9c2-kardiomyocyter med hjälp av helcellspatchklämtekniken.

Abstract

Kaliumkanaler på myokardialcellmembranet spelar en viktig roll i regleringen av cellelektrofysiologiska aktiviteter. Som en av de viktigaste jonkanalerna är spänningsstyrda kaliumkanaler (Kv) nära förknippade med vissa allvarliga hjärtsjukdomar, såsom läkemedelsinducerad hjärtskada och hjärtinfarkt. I den aktuella studien användes helcellspatch-klämtekniken för att bestämma effekterna av 1,5 mM 4-aminopyridin (4-AP, en bredspektrum kaliumkanalhämmare) och akonitin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM och 200 μM) på Kv-kanalströmmen (IKv) i H9c2-kardiomyocyter. Det visade sig att 4-AP hämmade I Kv med cirka 54%, medan den hämmande effekten av AC på IKv visade en dosberoende trend (ingen effekt för 25 μM, 30% hämmande hastighet för 50 μM, 46% hämmande hastighet för 100 μM och 54% hämmande hastighet för 200 μM). På grund av egenskaperna hos högre känslighet och precision kommer denna teknik att främja utforskningen av kardiotoxicitet och de farmakologiska effekterna av etnomedicin som riktar sig mot jonkanaler.

Introduction

Jonkanaler är speciella integrerade proteiner inbäddade i cellmembranets lipid-dubbelskikt. I närvaro av aktivatorer bildar centra av sådana speciella integrerade proteiner mycket selektiva hydrofila porer, vilket gör att joner av lämplig storlek och laddning kan passera igenom på ett passivt transportsätt1. Jonkanaler är grunden för cellens excitabilitet och bioelektricitet och spelar en nyckelroll i en mängd olika cellulära aktiviteter2. Hjärtat levererar blod till andra organ genom regelbundna sammandragningar till följd av en excitation-sammandragningskopplad process initierad av åtgärdspotentialer3. Tidigare studier har bekräftat att genereringen av åtgärdspotentialer i kardiomyocyter orsakas av förändringen i intracellulär jonkoncentration, och aktiveringen och inaktiveringen av Na+, Ca2+ och K+ jonkanaler i humana kardiomyocyter leder till bildandet av åtgärdspotentialer i en viss sekvens 4,5,6. Störda spänningsstyrda kalium (Kv) kanalströmmar (IKv) kan förändra den normala hjärtrytmen, vilket leder till arytmier, som är en av de främsta dödsorsakerna. Därför är inspelning av IKv avgörande för att förstå mekanismerna för läkemedel för behandling av livshotande arytmier7.

Kv-kanalen är en viktig komponent i kaliumkanalen. Kv-kanalens koordinationsfunktion spelar en viktig roll i den elektriska aktiviteten och myokardiella kontraktiliteten hos däggdjurshjärtat 8,9,10. I kardiomyocyter beror amplituden och varaktigheten av åtgärdspotentialer på samledningen av utåtriktade K + -strömmar med flera Kv-kanalsubtyper11. Regleringen av Kv-kanalfunktionen är mycket viktig för den normala repolariseringen av hjärtåtgärdspotentialen. Även den minsta förändringen i Kv-konduktans påverkar kraftigt hjärtrepolarisering och ökar risken för arytmi12,13.

Som representant för en grundläggande metod inom cellulär elektrofysiologisk forskning kan en tätning med hög resistans mellan ett litet område av cellmembranet och en pipettspets för inspelning av helcellspatchklämma fastställas genom att applicera ett undertryck. Det kontinuerliga undertrycket gör att cellmembranet kommer i kontakt med pipettspetsen och fastnar på pipettens innervägg. Den resulterande kompletta elektriska kretsen gör att man kan registrera vilken enskild jonkanalström som helst över cellmembranets yta14. Denna teknik har en mycket hög känslighet för cellmembranets jonkanalström och kan användas för att detektera strömmar i alla jonkanaler, och applikationerna är extremt breda15. Dessutom, jämfört med fluorescerande märkning och radioaktiv märkning, har patch-clamp högre auktoritet och noggrannhet16. För närvarande har helcellspatch-clamp-tekniken använts för att detektera de traditionella kinesiska medicinkomponenterna som verkar på Kv-kanalströmmar17,18,19. använde till exempel helcellspatchklämtekniken och bekräftade att den effektiva komponenten i lotusfröet kan uppnå hämningen av Kv4.3-kanalen genom att blockera de aktiverade tillståndskanalerna19. Akonitin (AC) är en av de effektiva och aktiva ingredienserna i Aconitum-arter, såsom Aconitum carmichaeli Debx och Aconitum pendel Busch. Många studier har visat att överdoser av AC kan orsaka arytmier och till och med hjärtstillestånd20. Samspelet mellan växelström och spänningsstyrda jonkanaler leder till störning av intracellulär jonhomeostas, vilket är nyckelmekanismen för kardiotoxicitet21. Därför används i denna studie helcellens patch-klämteknik för att bestämma effekterna av AC på IKv av kardiomyocyter.

Protocol

De kommersiellt erhållna H9c2-råttkardiomyocyterna (se materialtabellen) inkuberades i DMEM innehållande 10% värmeinaktiverat fosterserum (FBS) och 1% penicillin-streptomycin vid 37 ° C i en 5%CO2 fuktad atmosfär. Helcellspatch-klämtekniken användes sedan för att detektera förändringarna i IKv i normala H9c2-celler och 4-AP- eller AC-behandlade celler (figur 1 och figur 2). 1. Be…

Representative Results

Detta protokoll tillät inspelning av IKv enligt de parametrar som ställts in i helcellens patch-clamp-teknik. IKv utlöstes av 150 ms depolariserande pulsstimulans från −40 till +60 mV vid en hållpotential på −60 mV (figur 3A). IKv av H9c2-råttkardiomyocyterna uppträdde först runt -20 mV, och sedan ökade amplituden med ytterligare depolarisering. Det genomsnittliga förhållandet mellan IKv och membranpotentialen beräknades utifrån d…

Discussion

Den elektrofysiologiska tekniken med lappklämma används huvudsakligen för att registrera och återspegla jonkanalernas elektriska aktivitet och funktionella egenskaper på cellmembranet25. För närvarande inkluderar de viktigaste inspelningsmetoderna för patch-clamp-tekniken enkanalsinspelning och helcellsinspelning26. För helcellsläget används glasmikroelektroden och undertrycket för att bilda en tätning med hög resistans mellan ett litet område av cellmembrane…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi uppskattar det ekonomiska stödet från National Natural Science Foundation of China (82130113) och Key R&D and Transformation Program för Science & Technology Department of Qinghai-provinsen (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
check_url/64805?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image