JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Зависимая от напряжения регистрация тока калия на кардиомиоцитах H9c2 с помощью метода цельноклеточного пластыря-зажима

Published: November 11, 2022
doi:
10.3791/64805
, , , , , , ,
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine,Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

Summary

Настоящий протокол описывает эффективный метод получения в режиме реального времени и динамического получения токов калиевого (Kv) канала с напряжением в кардиомиоцитах H9c2 с использованием метода зажима цельноклеточного пластыря.

Abstract

Калиевые каналы на клеточной мембране миокарда играют важную роль в регуляции электрофизиологической деятельности клеток. Будучи одним из основных ионных каналов, калиевые каналы с напряжением (Kv) тесно связаны с некоторыми серьезными заболеваниями сердца, такими как лекарственно-индуцированное повреждение миокарда и инфаркт миокарда. В настоящем исследовании был использован метод цельноклеточного пластырь-зажима для определения влияния 1,5 мМ 4-аминопиридина (4-AP, ингибитор калиевого канала широкого спектра действия) и аконитина (AC, 25 мкМ, 50 мкМ, 100 мкМ и 200 мкМ) на ток канала Kv (IKv) в кардиомиоцитах H9c2. Было установлено, что 4-AP ингибирует IKv примерно на 54%, в то время как ингибирующее действие AC на IKv показало дозозависимую тенденцию (отсутствие эффекта для 25 мкМ, 30% ингибирующая скорость для 50 мкМ, 46% ингибирующая скорость для 100 мкМ и 54% ингибирующая скорость для 200 мкМ). Благодаря характеристикам более высокой чувствительности и точности, этот метод будет способствовать исследованию кардиотоксичности и фармакологических эффектов этномедицины, нацеленной на ионные каналы.

Introduction

Ионные каналы представляют собой специальные интегрированные белки, встроенные в липидный бислой клеточной мембраны. В присутствии активаторов центры таких специальных интегрированных белков образуют высокоселективные гидрофильные поры, позволяющие ионам соответствующего размера и заряда проходить пассивным транспортным способом1. Ионные каналы являются основой возбудимости и биоэлектричества клеток и играют ключевую роль в различных клеточных активностях2. Сердце снабжает кровью другие органы посредством регулярных сокращений, возникающих в результате процесса возбуждения-сокращения, инициированного потенциалами действия3. Предыдущие исследования подтвердили, что генерация потенциалов действия в кардиомиоцитах обусловлена изменением внутриклеточной концентрации ионов, а активация и инактивация ионных каналов Na+, Ca2+ и K+ в кардиомиоцитах человека приводят к образованию потенциалов действия в определенной последовательности 4,5,6. Нарушенные напряжения калиевых (Kv) каналов (IKv) могут изменить нормальный сердечный ритм, что приводит к аритмиям, которые являются одной из ведущих причин смерти. Поэтому запись IKv имеет решающее значение для понимания механизмов препаратов для лечения угрожающих жизни аритмий7.

Канал Kv является важным компонентом калиевого канала. Координационная функция канала Kv играет важную роль в электрической активности и сократимости миокарда сердца млекопитающих 8,9,10. В кардиомиоцитах амплитуда и продолжительность потенциалов действия зависят от копроводности внешних токов K+ несколькими подтипамиKv-каналов 11. Регуляция функции канала Kv очень важна для нормальной реполяризации потенциала сердечного действия. Даже малейшее изменение проводимости Кв сильно влияет на реполяризацию сердца и увеличивает вероятность развития аритмиина 12,13.

Представляя собой фундаментальный метод в клеточных электрофизиологических исследованиях, высокопрочное уплотнение между небольшой площадью клеточной мембраны и наконечником пипетки для записи цельноклеточного зажима может быть установлено путем применения отрицательного давления. Непрерывное отрицательное давление заставляет клеточную мембрану соприкасаться с наконечником пипетки и прилипать к внутренней стенке пипетки. Полученная полная электрическая цепь позволяет регистрировать любой ток ионного канала через поверхность клеточной мембраны14. Этот метод имеет очень высокую чувствительность к току ионного канала клеточной мембраны и может быть использован для обнаружения токов во всех ионных каналах, а приложения чрезвычайношироки 15. Более того, по сравнению с флуоресцентной маркировкой и радиоактивной маркировкой, патч-зажим имеет более высокий авторитет и точность16. В настоящее время для обнаружения компонентов традиционной китайской медицины, действующих на токи канала Kv 17,18,19, используется метод цельноклеточного пластыря-зажима. Например, Wang et al. использовали технику зажима цельноклеточного пластыря и подтвердили, что эффективный компонент семени лотоса может достичь ингибирования канала Kv4.3 путем блокирования каналов активированного состояния19. Аконитин (AC) является одним из эффективных и активных ингредиентов видов Aconitum, таких как Aconitum carmichaeli Debx и Aconitum pendulum Busch. Многочисленные исследования показали, что передозировка АС может вызвать аритмию и даже остановку сердца20. Взаимодействие между переменным током и ионными каналами с напряжением приводит к нарушению внутриклеточного ионного гомеостаза, который является ключевым механизмом кардиотоксичности21. Поэтому в данном исследовании для определения влияния ПЕРЕМЕННОГО тока на IКв кардиомиоцитов используется методика цельноклеточных пластырей-зажимов.

Protocol

Коммерчески полученные кардиомиоциты крыс H9c2 (см. Таблицу материалов) инкубировали в DMEM, содержащем 10% инактивированной теплом фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% пенициллин-стрептомицина при 37 °C в 5% CO2 увлажненной атмосфере. Затем для обнаружения изменений в IKv в но?…

Representative Results

Этот протокол позволял записывать IKv в соответствии с параметрами, заданными в технике полноклеточного патч-зажима. IKv запускался 150 мс деполяризующего импульсного стимула от −40 до +60 мВ при удерживающем потенциале −60 мВ (рисунок 3А). IKv кардиомиоцитов к…

Discussion

Электрофизиологический метод патч-зажима в основном используется для регистрации и отражения электрической активности и функциональных характеристик ионных каналов на клеточной мембране25. В настоящее время основными методами записи патч-зажимной техники являются одно…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы ценим финансовую поддержку со стороны Национального фонда естественных наук Китая (82130113) и Программы ключевых исследований и разработок и трансформации Департамента науки и технологий провинции Цинхай (2020-SF-C33).

Materials

4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Keywords: Voltage-dependent Potassium CurrentWhole-cell Patch-clamp TechniqueH9C2 CardiomyocytesIon Channel ResearchPharmacological MechanismsCardiotoxicityMicropipette PullerBorosilicate Glass CapillaryDigital Analog ConverterSignal AmplifierMicro ManipulatorData Acquisition SoftwareLeak SubtractionMembrane Test
check_url/64805?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image