Microscopie à force atomique en mode contact en tant que technique rapide d’observation morphologique et d’analyse des dommages cellulaires bactériens
Summary
Ici, nous présentons l’application de la microscopie à force atomique (AFM) comme une méthode simple et rapide pour la caractérisation bactérienne et analysons des détails tels que la taille et la forme bactériennes, les biofilms de culture bactérienne et l’activité des nanoparticules en tant que bactéricides.
Abstract
La microscopie électronique est l’un des outils nécessaires pour caractériser les structures cellulaires. Cependant, la procédure est compliquée et coûteuse en raison de la préparation de l’échantillon pour l’observation. La microscopie à force atomique (AFM) est une technique de caractérisation très utile en raison de sa haute résolution en trois dimensions et de l’absence de toute exigence de vide et de conductivité de l’échantillon. AFM peut imager une grande variété d’échantillons avec différentes topographies et différents types de matériaux.
AFM fournit des informations topographiques 3D haute résolution du niveau angström à l’échelle du micron. Contrairement à la microscopie traditionnelle, AFM utilise une sonde pour générer une image de la topographie de surface d’un échantillon. Dans ce protocole, l’utilisation de ce type de microscopie est suggérée pour la caractérisation morphologique et cellulaire des bactéries fixées sur un support. Des souches de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), d’Escherichia coli (ATCC 25922) et de Pseudomonas hunanensis (isolées à partir d’échantillons de bulbes d’ail) ont été utilisées. Dans ce travail, des cellules bactériennes ont été cultivées dans des milieux de culture spécifiques. Pour observer les dommages cellulaires, Staphylococcus aureus et Escherichia coli ont été incubés avec différentes concentrations de nanoparticules (NP).
Une goutte de suspension bactérienne a été fixée sur un support en verre, et des images ont été prises avec AFM à différentes échelles. Les images obtenues ont montré les caractéristiques morphologiques de la bactérie. De plus, en utilisant l’AFM, il a été possible d’observer les dommages à la structure cellulaire causés par l’effet des NP. Sur la base des images obtenues, l’AFM de contact peut être utilisé pour caractériser la morphologie des cellules bactériennes fixées sur un support. L’AFM est également un outil approprié pour l’étude des effets des NP sur les bactéries. Comparée à la microscopie électronique, l’AFM est une technique peu coûteuse et facile à utiliser.
Introduction
Différentes formes bactériennes ont été relevées pour la première fois par Antony van Leeuwenhoek au 17ème siècle1. Les bactéries existent sous une grande diversité de formes depuis l’Antiquité, allant des sphères aux cellules ramifiées2. La forme cellulaire est une condition fondamentale pour les taxonomistes bactériens pour décrire et classer chaque espèce bactérienne, principalement pour la séparation morphologique des phylums à Gram positif et à Gram négatif3. Plusieurs éléments sont connus pour déterminer les formes cellulaires bactériennes, qui sont tous impliqués dans les couvertures cellulaires et le support en tant que composants de la paroi cellulaire et de la membrane, ainsi que dans le cytosquelette. De cette façon, les scientifiques continuent d’élucider les mécanismes et processus chimiques, biochimiques et physiques impliqués dans la détermination des formes cellulaires bactériennes, qui sont tous définis par des grappes de gènes qui définissent les formes bactériennes 2,4.
De plus, les scientifiques ont montré que la forme en bâtonnet est probablement la forme ancestrale des cellules bactériennes, puisque cette forme cellulaire semble optimale dans les paramètres significatifs des cellules. Ainsi, les cocci, les spirales, les vibrions, les filamenteux et d’autres formes sont considérés comme des adaptations à divers environnements; En effet, des morphologies particulières ont évolué indépendamment à plusieurs reprises, suggérant que les formes des bactéries pourraient être des adaptations à des environnements particuliers 3,5. Cependant, tout au long du cycle de vie des cellules bactériennes, la forme de la cellule change, et cela se produit également en réponse génétique à des conditions environnementales dommageables3. La forme et la taille des cellules bactériennes déterminent fortement la rigidité, la robustesse et le rapport surface/volume de la bactérie, et cette caractéristique peut être exploitée pour les procédés biotechnologiques6.
La microscopie électronique est utilisée pour étudier des échantillons biologiques en raison du fort grossissement qui peut être atteint au-delà des microscopes à base de lumière. La microscopie électronique à transmission (MET) et la microscopie électronique à balayage (MEB) sont les techniques les plus couramment utilisées à cette fin; Cependant, les échantillons nécessitent certains traitements avant d’être placés dans la chambre du microscope afin d’obtenir des images appropriées. Une couverture dorée sur les échantillons est nécessaire, et le temps utilisé pour l’acquisition totale de l’image ne doit pas être trop long. En revanche, la microscopie à force atomique (AFM) est une technique largement utilisée dans l’analyse des surfaces, mais est également utilisée dans l’étude d’échantillons biologiques.
Il existe plusieurs types de modes AFM utilisés dans l’analyse de surface, tels que le mode contact, le mode sans contact ou le tapotement, la microscopie à force magnétique (MFM), l’AFM conductrice, la microscopie à force piézoélectrique (PFM), le tapping de la force de crête (PFT), la résonance de contact et le volume de force. Chaque mode est utilisé dans l’analyse des matériaux et fournit des informations différentes sur la surface des matériaux et leurs propriétés mécaniques et physiques. Cependant, certains modes AFM sont utilisés pour l’analyse d’échantillons biologiques in vitro, comme le PFT, car le PFT permet d’obtenir des données topographiques et mécaniques sur des cellules en milieu liquide7.
Dans ce travail, nous avons utilisé le mode le plus basique inclus dans chaque modèle AFM ancien et simple: le mode contact. AFM utilise une sonde pointue (environ <50 nm de diamètre) pour balayer les zones inférieures à 100 μm. La sonde est alignée sur l’échantillon afin d’interagir avec les champs de force associés à l’échantillon. La surface est balayée avec la sonde pour maintenir la force constante. Ensuite, une image de la surface est générée en surveillant le mouvement du porte-à-faux lorsqu’il se déplace sur la surface. Les informations recueillies fournissent les propriétés nanomécaniques de la surface, telles que l’adhérence, l’élasticité, la viscosité et le cisaillement.
En mode de contact AFM, le porte-à-faux est balayé à travers l’échantillon à une déviation fixe. Cela permet de déterminer la hauteur des échantillons (Z), ce qui représente un avantage par rapport aux autres techniques de microscope électronique. Le logiciel AFM permet la génération d’un balayage d’image 3D par l’interaction entre la pointe et la surface de l’échantillon, et la déviation de la pointe est corrélée à la hauteur de l’échantillon grâce à un laser et un détecteur.
En mode statique (mode contact) à force constante, la sortie présente deux images différentes : la hauteur (topographie z) et la déviation ou le signal d’erreur. Le mode statique est un mode d’imagerie simple et précieux, en particulier pour les échantillons robustes dans l’air qui peuvent supporter les charges élevées et les forces de torsion exercées par le mode statique. Le mode de déflexion ou d’erreur est utilisé en mode force constante. Cependant, l’image topographique est encore améliorée en ajoutant le signal de déviation à la structure de surface. Dans ce mode, le signal de déviation est également appelé signal d’erreur car la déviation est le paramètre de rétroaction ; Toutes les caractéristiques ou morphologies qui apparaissent dans ce canal sont dues à « l’erreur » dans la boucle de rétroaction ou, plutôt, à la boucle de rétroaction nécessaire pour maintenir un point de consigne de déflexion constant.
La conception unique de l’AFM le rend compact – assez petit pour tenir sur une table – tout en ayant une résolution suffisamment élevée pour résoudre les étapes atomiques. L’équipement AFM a un coût inférieur à celui des autres microscopes électroniques et les coûts de maintenance sont minimes. Le microscope ne nécessite pas de laboratoire avec des conditions spéciales telles qu’une salle blanche ou un espace isolé; Il n’a besoin que d’un bureau sans vibrations. Pour l’AFM, les échantillons n’ont pas besoin de subir une préparation élaborée comme pour d’autres techniques (couverture dorée, minceur); Seul un échantillon sec doit être fixé au porte-échantillon.
Nous utilisons le mode de contact AFM pour observer les morphologies bactériennes et les effets des NP. La population et la morphologie cellulaire des bactéries fixées sur un support peuvent être observées, ainsi que les dommages cellulaires produits par les nanoparticules sur les espèces bactériennes. Les images obtenues par le mode contact AFM confirment qu’il s’agit d’un outil puissant et qu’il n’est pas limité par des réactifs et des procédures compliquées, ce qui en fait une méthode simple, rapide et économique pour la caractérisation bactérienne.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microscopie est une technique couramment utilisée dans les laboratoires biologiques qui permet d’étudier la structure, la taille, la morphologie et la disposition cellulaire des échantillons biologiques. Pour améliorer cette technique, plusieurs types de microscopes peuvent être utilisés qui diffèrent les uns des autres en termes de caractéristiques optiques ou électroniques, qui déterminent le pouvoir de résolution de l’instrument.
Dans la recherche scientifique, l’utilisa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ramiro Muniz-Diaz remercie CONACyT pour la bourse.
Materials
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
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