रूपात्मक अवलोकन और बैक्टीरियल सेल क्षति विश्लेषण के लिए एक त्वरित तकनीक के रूप में संपर्क मोड परमाणु बल माइक्रोस्कोपी
Summary
यहां, हम जीवाणु लक्षण वर्णन के लिए एक सरल और तेज़ विधि के रूप में परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) के आवेदन को प्रस्तुत करते हैं और बैक्टीरिया के आकार और आकार, बैक्टीरियल कल्चर बायोफिल्म और जीवाणुनाशकों के रूप में नैनोकणों की गतिविधि जैसे विवरणों का विश्लेषण करते हैं।
Abstract
इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी सेलुलर संरचनाओं को चिह्नित करने के लिए आवश्यक उपकरणों में से एक है। हालांकि, अवलोकन के लिए नमूना तैयार करने के कारण प्रक्रिया जटिल और महंगी है। परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) तीन आयामों में इसके उच्च रिज़ॉल्यूशन के कारण और वैक्यूम और नमूना चालकता के लिए किसी भी आवश्यकता की अनुपस्थिति के कारण एक बहुत ही उपयोगी लक्षण वर्णन तकनीक है। एएफएम विभिन्न टोपोग्राफऔर विभिन्न प्रकार की सामग्रियों के साथ विभिन्न प्रकार के नमूनों की छवि बना सकता है।
एएफएम एंगस्ट्रॉम स्तर से माइक्रोन पैमाने तक उच्च-रिज़ॉल्यूशन 3 डी स्थलाकृति जानकारी प्रदान करता है। पारंपरिक माइक्रोस्कोपी के विपरीत, एएफएम एक नमूने की सतह स्थलाकृति की छवि उत्पन्न करने के लिए एक जांच का उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल में, इस प्रकार की माइक्रोस्कोपी का उपयोग एक समर्थन पर तय बैक्टीरिया के रूपात्मक और कोशिका क्षति लक्षण वर्णन के लिए सुझाया जाता है। स्टेफिलोकोकस ऑरियस (एटीसीसी 25923), एस्चेरिचिया कोलाई (एटीसीसी 25922), और स्यूडोमोनास हुनानेंसिस (लहसुन बल्ब के नमूनों से अलग) के उपभेदों का उपयोग किया गया था। इस काम में, बैक्टीरिया कोशिकाओं को विशिष्ट संस्कृति मीडिया में उगाया गया था। सेल क्षति का निरीक्षण करने के लिए, स्टेफिलोकोकस ऑरियस और एस्चेरिचिया कोलाई को नैनोकणों (एनपी) की विभिन्न सांद्रता के साथ इनक्यूबेट किया गया था।
बैक्टीरियल सस्पेंशन की एक बूंद को ग्लास सपोर्ट पर तय किया गया था, और अलग-अलग पैमानों पर एएफएम के साथ छवियां ली गई थीं। प्राप्त छवियों ने बैक्टीरिया की रूपात्मक विशेषताओं को दिखाया। इसके अलावा, एएफएम को नियोजित करते हुए, एनपी के प्रभाव के कारण सेलुलर संरचना को होने वाले नुकसान का निरीक्षण करना संभव था। प्राप्त छवियों के आधार पर, संपर्क एएफएम का उपयोग एक समर्थन पर तय बैक्टीरिया कोशिकाओं की आकृति विज्ञान को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। एएफएम बैक्टीरिया पर एनपी के प्रभावों की जांच के लिए भी एक उपयुक्त उपकरण है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी की तुलना में, एएफएम एक सस्ती और उपयोग में आसान तकनीक है।
Introduction
विभिन्न जीवाणु आकृतियों को पहली बार 17वीं शताब्दी में एंटनी वैन लीउवेनहोक द्वारा नोट किया गया था। बैक्टीरिया प्राचीन काल से आकार की एक बड़ी विविधता में मौजूद हैं, जो गोले से लेकर शाखाओं की कोशिकाओं तकहैं। सेल आकार बैक्टीरियल टैक्सोनॉमिस्टों के लिए प्रत्येक जीवाणु प्रजातियों का वर्णन और वर्गीकरण करने के लिए एक मौलिक स्थिति है, मुख्य रूप से ग्राम-पॉजिटिव और ग्राम-नेगेटिव फ़ाइला3 के रूपात्मक पृथक्करण के लिए। कई तत्व बैक्टीरिया सेल रूपों को निर्धारित करने के लिए जाने जाते हैं, जिनमें से सभी सेल कवर में शामिल होते हैं और सेल की दीवार और झिल्ली के घटकों के साथ-साथ साइटोस्केलेटन में भी समर्थन करते हैं। इस तरह, वैज्ञानिक अभी भी रासायनिक, जैव रासायनिक और भौतिक तंत्र और प्रक्रियाओं को स्पष्ट कर रहे हैं जो बैक्टीरिया कोशिका रूपों को निर्धारित करने में निहित हैं, जिनमें से सभी जीन के समूहों द्वारा परिभाषित किए जाते हैं जो बैक्टीरिया के आकार 2,4 को परिभाषित करते हैं।
इसके अतिरिक्त, वैज्ञानिकों ने दिखाया है कि रॉड का आकार संभवतः बैक्टीरिया कोशिकाओं का पैतृक रूप है, क्योंकि यह सेल आकार सेल-महत्वपूर्ण मापदंडों में इष्टतम दिखाई देता है। इस प्रकार, कोकी, सर्पिल, विब्रियो, फिलामेंटस और अन्य रूपों को विभिन्न वातावरणों के अनुकूलन के रूप में माना जाता है; दरअसल, विशेष आकृति विज्ञान स्वतंत्र रूप से कई बार विकसित हुए हैं, यह सुझाव देते हुए कि बैक्टीरिया के आकार विशेष वातावरण 3,5 के अनुकूलन हो सकते हैं। हालांकि, बैक्टीरिया कोशिका जीवन चक्र के दौरान, कोशिका का आकार बदल जाता है, और यह हानिकारकपर्यावरणीय परिस्थितियों के लिए आनुवंशिक प्रतिक्रिया के रूप में भी होता है। बैक्टीरियल सेल आकार और आकार बैक्टीरिया की कठोरता, मजबूती और सतह-से-मात्रा अनुपात को दृढ़ता से निर्धारित करते हैं, और इस विशेषता का उपयोग जैवप्रौद्योगिकी प्रक्रियाओं के लिए किया जा सकता है।
इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोपी का उपयोग उच्च आवर्धन के कारण जैविक नमूनों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है जिसे प्रकाश-आधारित माइक्रोस्कोप से परे पहुंचा जा सकता है। ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (टीईएम) और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (एसईएम) इस उद्देश्य के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल की जाने वाली तकनीकें हैं; हालांकि, नमूनों को उचित चित्र प्राप्त करने के लिए माइक्रोस्कोप के कक्ष में रखने से पहले कुछ उपचारों की आवश्यकता होती है। नमूने पर एक सोने के कवर की आवश्यकता होती है, और कुल छवि अधिग्रहण के लिए उपयोग किया जाने वाला समय बहुत लंबा नहीं होना चाहिए। इसके विपरीत, परमाणु बल माइक्रोस्कोपी (एएफएम) एक तकनीक है जिसका व्यापक रूप से सतहों के विश्लेषण में उपयोग किया जाता है, लेकिन जैविक नमूनों के अध्ययन में भी नियोजित किया जाता है।
सतह विश्लेषण में कई प्रकार के एएफएम मोड का उपयोग किया जाता है, जैसे संपर्क मोड, गैर-संपर्क मोड या टैपिंग, चुंबकीय बल माइक्रोस्कोपी (एमएफएम), प्रवाहकीय एएफएम, पीजोइलेक्ट्रिक फोर्स माइक्रोस्कोपी (पीएफएम), पीक फोर्स टैपिंग (पीएफटी), संपर्क अनुनाद और बल की मात्रा। प्रत्येक मोड का उपयोग सामग्री के विश्लेषण में किया जाता है और सामग्री की सतह और उनके यांत्रिक और भौतिक गुणों के बारे में अलग-अलग जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, कुछ एएफएम मोड का उपयोग इन विट्रो में जैविक नमूनों के विश्लेषण के लिए किया जाता है, जैसे कि पीएफटी, क्योंकि पीएफटी एक तरल माध्यम7 में कोशिकाओं पर स्थलाकृतिक और यांत्रिक डेटा प्राप्त करने की अनुमति देता है।
इस काम में, हमने हर पुराने और सरल एएफएम मॉडल में शामिल सबसे बुनियादी मोड का उपयोग किया- संपर्क मोड। एएफएम 100 μm से कम क्षेत्रों को स्कैन करने के लिए एक तेज जांच (लगभग <50 एनएम व्यास) का उपयोग करता है। नमूने से जुड़े बल क्षेत्रों के साथ बातचीत करने के लिए जांच को नमूने के साथ संरेखित किया गया है। बल को स्थिर रखने के लिए सतह को जांच के साथ स्कैन किया जाता है। फिर, कैंटिलीवर की गति की निगरानी करके सतह की एक छवि उत्पन्न की जाती है क्योंकि यह सतह के पार चलती है। एकत्रित जानकारी सतह के नैनो-मैकेनिकल गुण प्रदान करती है, जैसे आसंजन, लोच, चिपचिपाहट और कतरनी।
एएफएम संपर्क मोड में, कैंटिलीवर को एक निश्चित विक्षेपण पर नमूने में स्कैन किया जाता है। यह नमूने (जेड) की ऊंचाई निर्धारित करने की अनुमति देता है, और यह अन्य इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोप तकनीकों पर एक लाभ का प्रतिनिधित्व करता है। एएफएम सॉफ्टवेयर टिप और नमूना सतह के बीच बातचीत द्वारा 3 डी छवि स्कैन की पीढ़ी की अनुमति देता है, और टिप विक्षेपण एक लेजर और एक डिटेक्टर के माध्यम से नमूने की ऊंचाई से संबंधित है।
स्थिर बल के साथ स्थैतिक मोड (संपर्क मोड) में, आउटपुट दो अलग-अलग छवियां प्रस्तुत करता है: ऊंचाई (जेड स्थलाकृति) और विक्षेपण या त्रुटि संकेत। स्थैतिक मोड एक मूल्यवान, सरल इमेजिंग मोड है, विशेष रूप से हवा में मजबूत नमूनों के लिए जो स्थैतिक मोड द्वारा लगाए गए उच्च भार और मरोड़ बलों को संभाल सकते हैं। विक्षेपण या त्रुटि मोड निरंतर बल मोड में संचालित होता है। हालांकि, सतह संरचना में विक्षेपण संकेत जोड़कर स्थलाकृति छवि को और बढ़ाया जाता है। इस मोड में, विक्षेपण संकेत को त्रुटि संकेत के रूप में भी जाना जाता है क्योंकि विक्षेपण प्रतिक्रिया पैरामीटर है; इस चैनल में दिखाई देने वाली कोई भी विशेषता या आकृति विज्ञान फीडबैक लूप में “त्रुटि” के कारण है या, बल्कि, निरंतर विक्षेपण सेटपॉइंट बनाए रखने के लिए आवश्यक प्रतिक्रिया लूप के कारण है।
एएफएम का अनूठा डिजाइन इसे कॉम्पैक्ट बनाता है – टेबलटॉप पर फिट होने के लिए काफी छोटा – जबकि परमाणु चरणों को हल करने के लिए पर्याप्त रिज़ॉल्यूशन भी है। एएफएम उपकरण में अन्य इलेक्ट्रॉनिक माइक्रोस्कोप के लिए उपकरणों की तुलना में कम लागत है, और रखरखाव लागत न्यूनतम है। माइक्रोस्कोप को विशेष परिस्थितियों जैसे कि एक साफ कमरे या एक पृथक स्थान के साथ एक प्रयोगशाला की आवश्यकता नहीं होती है; इसे केवल एक कंपन-मुक्त डेस्क की आवश्यकता होती है। एएफएम के लिए, नमूनों को अन्य तकनीकों (गोल्ड कवर, स्लिमिंग) की तरह विस्तृत तैयारी से गुजरने की आवश्यकता नहीं है; केवल एक सूखा नमूना नमूना धारक के साथ संलग्न किया जाना है।
हम बैक्टीरिया आकृति विज्ञान और एनपी के प्रभावों का निरीक्षण करने के लिए एएफएम संपर्क मोड का उपयोग करते हैं। एक समर्थन पर तय बैक्टीरिया की आबादी और सेलुलर आकृति विज्ञान को देखा जा सकता है, साथ ही बैक्टीरिया प्रजातियों पर नैनोकणों द्वारा उत्पादित सेलुलर क्षति भी। एएफएम संपर्क मोड द्वारा प्राप्त छवियां पुष्टि करती हैं कि यह एक शक्तिशाली उपकरण है और अभिकर्मकों और जटिल प्रक्रियाओं तक सीमित नहीं है, जिससे यह बैक्टीरिया के लक्षण वर्णन के लिए एक सरल, तेज और किफायती तरीका बन जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
माइक्रोस्कोपी आमतौर पर जैविक प्रयोगशालाओं में उपयोग की जाने वाली तकनीक है जो जैविक नमूनों की संरचना, आकार, आकृति विज्ञान और सेलुलर व्यवस्था की जांच के लिए अनुमति देती है। इस तकनीक को बेहतर बनाने के लि?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
रामिरो मुनीज-डियाज़ छात्रवृत्ति के लिए CONACyT को धन्यवाद देते हैं।
Materials
| AFM EasyScan 2 | NanoSurf | discontinued | Measurement Media |
| bacteriological loop | No aplica | not applicable | instrument for bacterial inoculation |
| BigDye Terminator v3.1 | ThermoFisher Scientific | 4337455 | Matrix installation kit |
| Bioedit | not applicable | version 7.2.5 | Sequence alignment editor |
| Cary 60 spectrometer | Agilent Technologies | not applicable | |
| ceftriazone | Merck | not applicable | antibiotic |
| centrifuge | eppendorf | not applicable | to remove particles that interfere with AFM |
| ContAI-G Silicon cantilever | BudgetSensors | ContAl-G-10 | Measurement Media |
| eosin and methylene blue agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Escherichia coli | American Type Culture Collection | ATCC 25922 | bacterial strain |
| GoTaq Flexi DNA Polymerase | Promega | M8295 | PCR of 16S rRNA gene |
| microplate | Thermo Scientific | 10558295 | for microdilution analysis |
| Müller-Hinton broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutrient agar | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| nutritious broth | Merck | not applicable | bacterial culture medium |
| Petri dishes | not applicable | not applicable | growth of bacteria |
| Pseudomonas hunanensis 9AP | not applicable | not applicable | isolated from the garlic bulb by CNRG |
| Sanger sequencing | Macrogen | not applicable | sequencing service |
| ScienceDesk Anti-Vibration workstation | ThorLabs | ||
| slides | not applicable | not applicable | glass holder for bacterial sample analysis |
| Staphylococcus aureus | American Type Culture Collection | ATCC 25923 | bacterial strain |
| Thermalcycler | Applied Biosystems | Veriti-4375786 | PCR amplification |
| Trypticasein soy agar | BD | BA-256665 | growth media |
| ultrasonicator | Cole-Parmer Ultrasonic Processor, 220 VAC | not applicable | for mixing the nanoparticle dilutions |
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