本研究详细介绍了确定慢性样兔肩袖 (RC) 损伤的程序。具体来说,损伤是在肩胛下肌 (SSC) 肌腱/肌腱单位产生的,以模拟人类 RC 解剖学和病理生理学,包括严重的肌肉脂肪变性 (FD)。该协议可用于研究RC损伤和评估再生疗法。
兔肩袖 (RC) 病理生理学可导致其相关肌肉组织和肌腱发生进行性和高度退行性变化,从而对临床相关参数产生负面影响,例如肌腱/肌腱单位的力量和回缩,最终导致肩部功能丧失并对 RC 修复结果产生负面影响。模拟人类RC解剖学和病理生理学方面的动物模型对于推进对损伤进展的概念理解以及开发有效的组织工程和基于再生医学的疗法至关重要。
在这种情况下,兔肩胛下肌 (SSC) 模型是合适的,因为 (i) 它在解剖学上与人类冈上肌 (SSP) 骨-肌腱-肌肉单位相似,后者是最常受伤的 RC 部位;(ii)在纤维化和肌肉脂肪变性(FD)方面与人类的病理生理学相似性;及(iii)其适合外科手术。因此,本研究的目的是描述诱发 SSC RC 损伤的手术技术。简而言之,该手术涉及通过识别喙臂肌,然后在肌肉-肌腱连接处进行全层横切,并用硅基彭罗斯管包裹肌肉-肌腱连接处的自由端来隔离 SSC,以防止自发性重新连接。使用苏木精和伊红 (H&E) 以及 Masson 三色染色进行组织学评估以监测术后 4 周肌肉 FD 的进展。
SSC 肌腱连接横断后 4 周肌肉和 FD 的丧失很明显,类似于人类 RC 的病理生理状况。该协议演示了成功建立慢性样兔SSC RC损伤模型的步骤,该模型可以作为研究与RC病理生理学相关的骨骼肌变化的有力工具,并有助于开发慢性样RC撕裂的新型治疗策略。
慢性肩袖 (RC) 撕裂的特征是肌肉组织和肌腱的退行性变化,包括肌肉萎缩、脂肪组织堆积和纤维化,这可能会影响 RC 修复的结果,并最终导致肩部疼痛和功能障碍 1,2,3,4,5 .为了更好地了解 RC 撕裂的发病机制并改善手术结果,开发能够模拟人类 RC 解剖学和病理生理学方面的适当动物模型至关重要。具体而言,RC 损伤模型应满足以下标准:(i) 损伤后缺乏自愈;(ii) 含有大量纤维化、肌肉萎缩和脂肪组织堆积;(iii) 具有足够的尺寸,以允许近似于人类使用的手术技术6.
在这种情况下,兔肩胛下肌 (SSC) 肌肉可用作 RC 病理生理学研究的准确可靠的动物模型,因为它具有独特的解剖结构、病理生理反应和生物力学特性7。事实上,兔 SSC RC 解剖结构类似于人类冈上肌 (SSP) RC,后者是最常与过度使用引起的损伤相关的肌肉肌腱单位 8,9。具体来说,兔SSC肌腱复合体穿过骨隧道和喙臂肌下方,这类似于人类SSP肌腱复合体穿过肩峰下骨隧道和喙肩峰韧带下的情况7。这种解剖学上的相似性导致兔 SSC 经历与人类 SSP 相似的肌肉骨骼运动,其中肌腱在肱骨抬高和外展期间在肩峰下移动 7,10。
此外,在 SSC 撕裂后,在兔子中观察到类似于人类 RC 撕裂11 的病理组织学变化。具体来说,肌肉腹部经历严重的FD,肌肉质量显着下降,肌纤维横截面积减少,肥胖增加。此外,Otarodifard等人评估了(1)单排、(2)双排和(3)经骨等效RC修复技术后兔SSC的生物力学特性,发现这些修复的初始生物力学特征与在尸体标本中进行的人类SSP RC修复相似12。因此,兔 SSC 与人类 SSP 的解剖学、生理学和生物力学相似性使其可用于模拟 RC 损伤。
尽管包括大鼠、小鼠、狗和绵羊在内的许多动物物种已被用于研究 RC 疾病和修复 6,13,14,15,但损伤程度慢性是一个关键考虑因素。这是因为 RC 撕裂可能没有症状,并且通常在撕裂扩大并变成慢性时被诊断出来,肌腱和肌肉都表现出严重的退行性变16,17,18。然而,大多数 RC 修复模型采用急性损伤模型,其中健康肌腱被横断面,然后立即修复 19,20,21,22。这主要是出于后勤上的权宜之计和技术上的便利性,导致很少有研究在类似慢性的环境中检查 RC 病理生理学。此外,一些动物模型可能具有阻碍其用于慢性RC研究的属性。
例如,尽管大鼠已被广泛用于模拟 RC 撕裂和干预,但损伤后缺乏显着的脂肪积累与人类状况形成鲜明对比,并且其小尺寸使重复外科手术具有挑战性23。此外,尽管 Gerber 等人使用绵羊的冈下肌来研究慢性 RC 撕裂后的肌肉萎缩和 FD24,但绵羊冈下肌和人类 SSP 之间存在一些解剖学上的差异,以及研究和饲养如此大型动物模型的众多后勤挑战。此外,Gerber 等人通过释放冈下肌和肌腱的浅表头部来模拟慢性 RC 撕裂的特征,在绵羊中建立了延迟 RC 损伤模型,然后在 4 至 6 周时评估了不同修复技术对肌腱的疗效。不幸的是,这种慢性绵羊模型具有局限性,因为在第二次外科手术中,释放的肌腱末端与疤痕组织无法区分25。
Coleman 等人还通过在初次手术时用合成膜覆盖横腱末端来开发绵羊的慢性 RC 撕裂模型,该模型允许营养扩散并有效地最大限度地减少受伤组织周围的疤痕组织形成,同时提高肌腱和疤痕组织之间的区分26.同时,Turner 等人建议应在 4 周内进行延迟修复,因为在大肌腱回缩中很少发生直接再附着27。总之,这些研究为成功建立慢性样兔SSC RC损伤模型提供了可重复和可靠的方案。
在该协议中,在 4 周时建立慢性样兔 RC 损伤模型,其中 可以通过组织学 评估研究与纤维化和 FD 介导的肌肉萎缩相关的病理变化。特别是,在初次手术时使用硅基彭罗斯管包裹肌肉-肌腱连接处的自由端,可以在第二次手术过程中清楚地识别 RC 组织,从而促进安全修复以研究有和没有支架增强的 RC 愈合。总而言之,慢性样兔 SSC 模型可以更好地模拟 RC 病理生理学,并提出最低限度的技术和后勤要求。
可重复且具有生理学相关性的动物模型能够促进对疾病发病机制的理解,评估临床治疗的结果,并改进和进一步开发手术治疗35。在这项研究中,建立了一个可靠且准确的兔SSC模型,该模型模拟了人类RC解剖学和病理生理学的各个方面。RC 撕裂与进行性且可能不可逆的肌肉退行性变化有关,导致愈合潜力降低。例如,Ko等人表明,兔SSP在6周时重新附着并没有在接下来的6周内逆转肌肉萎缩或FD。这种FD介导的肌肉萎缩会影响几个重要的临床参数,包括肌腱肌肉力量和关节活动度,这可能会影响手术结果36,37。
这里建立的方案在SSC肌肉肌腱单位横断后显示出显着的慢性样属性。具体来说,这些变化包括肌肉质量明显减少,脂肪含量和纤维化组织增加(图2、图3和图4)。这些发现与人类 RC 泪液中报告的退行性变化一致38。近年来,由于大鼠与肩峰38、39、40 下行进的人类和大鼠 SSP 在解剖学上具有高度相似性,因此已成为研究最深入的 RC 疾病和损伤动物模型之一。然而,应该注意的是,在肩峰弓下通过的大鼠SSP部分是肌肉的,而不是肌腱的,这在人类中是这种情况41。最重要的是,Barton 等人认识到大鼠23 的 SSP 肌腱脱离后缺乏明显的脂肪堆积,这与人类状况42 形成鲜明对比。因此,据信兔SSC复合物可能提供适当的模型来模拟人类的慢性RC撕裂。
为了保证该模型的可重复性,在执行该协议时有两点值得注意。首先,在肌肉-肌腱单位横断后,横贯肌腱的自由端可能有形成粘连的风险,这可能使肌腱取回对后续操作具有挑战性。为了避免这个问题,使用不可吸收的硅胶管在横断后包裹肌肉-肌腱连接处的自由端,以避免自发粘附到周围组织以及自发愈合(图1E)。此外,在第二次干预手术期间(即进行安全修复;数据未显示)期间的横断肌腱单元可以通过在初次手术时包裹受伤组织的末端来清楚地识别。该技术经济、有效,并且可以很容易地在手术中实施43。其次,兔子是一种高度敏感的物种,手术后可能会表现出有害行为。为避免此类问题,强烈建议还使用软项圈以防止不良行为,包括自残、舔手术部位和拆线(图 1I)。与市面上传统的硬质塑料电子项圈相比,自制的软项圈不会造成任何皮肤损伤或其他影响动物福利或科学探究质量的副作用。总之,这些步骤对于创建准确可重复的兔RC损伤模型至关重要,并为研究再生修复策略提供了可能性。
为了在动物模型中研究肌腱病理生理学和愈合,必须创建独特且可重复的损伤,并且必须仔细选择研究时间点。绝大多数关于肌腱损伤和愈合的研究都是在完全横断的动物肌腱上进行的 44,因为横断是一种简单的过程,具有高度可重复性,可以充分模拟临床场景45,46。Huegel 等人表明,部分横断肌腱的损伤不如完全横断肌腱的损伤严重,并且固定对肌腱力学有不利影响,包括关节刚度增加47。为了评估在大量 RC 撕裂情况下看到的萎缩和 FD,必须定义实验观察到的特征时间点。Gupta等人验证了雄性兔子的RC损伤模型,并在2周和6周的时间点观察到肌肉萎缩,在以后的时间点脂肪含量增加(2周时脂肪含量低于5%,而6周时脂肪含量超过10%),与在人类RC眼泪中观察到的病理过程一致11。在这项研究中,通过横切雄性和雌性兔子的 SSC 肌肉-肌腱单元 4 周而产生大量 RC 撕裂,导致 SSC 肌肉 FD(脂肪含量为 36.5%)。因此,4 周的时间点适合在雄性和雌性新西兰大白兔中产生 SSC 肌肉 FD。
本研究存在一些局限性。这些包括:(i)与动物模型生成相关的步骤,例如相对较短的时间点和用于慢性损伤生成的潜在炎症材料(硅基彭罗斯管);(ii)动物模型表征和分析,例如缺乏步态分析和肌电图来评估关节运动学和肌肉收缩力的产生;(iii)动物模型比较,例如缺乏与其他RC损伤部位的比较。
在模型生成方面,人类 RC 损伤通常涉及进行性萎缩和 FD,可能发生在几年内,这比这里报告的 4 周时间点要长。这被认为是可以接受的,因为在相对较短的时间内产生约36.5%肌内脂肪的动物模型在后勤上是方便的,如果认为有必要,可以延长。此外,由于细胞免疫反应和炎症的报道,硅基植入物(如彭罗斯管)的生物相容性一直是长期争议的根源47;因此,如果进行炎症相关 RC 研究,可以使用替代惰性材料(例如聚乙二醇 (PEG))来包裹切除的肌腱。
在动物模型表征和分析方面,缺乏步态分析49 和肌电图研究50 可能会将研究结果限制在定性组织学数据上。这些方面可以在未来的研究中通过使用视频运动分析51 和表面肌电图50 来生成有关肩部运动学和RC肌肉性能的定量数据来解决。
在模型比较方面,由于兔子的SSP和冈下肌腱也被广泛用于RC研究,因此未来比较这些不同损伤部位的损伤严重程度,包括FD,将确定模型优化的其他部位。
总之,本研究开发了一种用于模拟雄性和雌性兔子慢性样 RC 损伤的方案。该模型对研究人员来说很方便,因为它简单(横断)和相对较短的时间诱发慢性(4 周),同时产生很大程度 (36.5%) 的肌内 FD。因此,该协议有望帮助研究人员研究 RC 病理生理学,并促进肌肉肌腱修复和再生新疗法的开发。
The authors have nothing to disclose.
Dai Fei Elmer Ker的研究得到了香港特别行政区食物及卫生局(健康医疗及研究基金:08190466)、香港特别行政区创新科技署(第3级奖项:ITS/090/18;Health@InnoHK计划)、香港特别行政区香港研究资助局(杰出青年学者计划奖:24201720及优配研究金:14213922)及香港中文大学(学院创新奖:FIA2018/A/01)。王丹的研究得到了香港特别行政区食物及卫生局(卫生医学研究基金,07180686)、香港特别行政区创新科技署(第3级奖项:ITS/333/18;Health@InnoHK计划)和香港特别行政区香港研究资助局(优配研究金:14118620及14121121)。
Surgical tools | |||
4-0 Poly glycolic acid (PGA) | e-Sutures | GBK884 | |
Forceps with teeth | Taobao, China | ||
Fine scissors | Taobao, China | ||
Hemostatic forceps | Taobao, China | ||
Needle holders | Taobao, China | ||
Surgical scalpel with handle | Taobao, China | 11 | |
Suture (4-0 Silk) | Taobao, China | 19054 | |
Surgical accessories | |||
Cotton balls | Taobao, China | ||
Gauze | Taobao, China | ||
Razor | Taobao, China | ||
Surgical heating pad | Taobao, China | ||
Surgical lamp | |||
Syringe with needles | Taobao, China | 1 mL, 5 mL, 10 mL | |
Drugs | |||
Buprenorphine | LASEC, CUHK | 0.12 mg/kg | |
Bupivacaine | Tin Hang Tech | b5274-5g | 1-2 mg/kg |
Cephalexin | Santa Cruz Biotechnology (Genetimes) | sc-487556 | 20 mg/kg |
Ketamine | LASEC, CUHK | 35 mg/kg | |
Sodium pentobarbital | LASEC, CUHK | more than 60 mg/kg | |
Xylazine | LASEC, CUHK | 5 mg/kg | |
Equipment | |||
Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope | Nikon Instruments Inc, USA | ||
Software | |||
Adobe Photoshop 20.01 | Adobe Inc, USA | ||
Other reagents | |||
Betadine | Taobao, China | 5% | |
Ethanol | Taobao, China | 70% | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | EDS-1KG | 10% |
Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 4% |
Silicone tubing | Easy Thru, China | ISO13485 | |
Saline | Taobao, China | ||
Histological staining reagents | |||
Eosin Stain Solution | Sigma-Aldrich | R03040 | 5% Aqueous |
Hematoxylin Solution | Sigma-Aldrich | HHS32 | |
Trichrome Stain (Masson) Kit | Sigma-Aldrich | HT15 |