Dit protocol beschrijft een eenvoudige en minimaal invasieve methode voor het transplanteren en afbeelden van NIT-1-cellen in niet-obese diabetische (NOD) -ernstige gecombineerde immunodeficiënte muizen die worden uitgedaagd met splenocyten gezuiverd van spontaan diabetische NOD-muizen.
Type 1 diabetes wordt gekenmerkt door de auto-immuunvernietiging van de insulineproducerende bètacellen van de alvleesklier. Een veelbelovende behandeling voor deze ziekte is de transplantatie van van stamcellen afgeleide bètacellen. Genetische modificaties kunnen echter nodig zijn om de getransplanteerde cellen te beschermen tegen aanhoudende auto-immuniteit. Diabetische muismodellen zijn een nuttig hulpmiddel voor de voorlopige evaluatie van strategieën om getransplanteerde cellen te beschermen tegen auto-immuunaanvallen. Hier wordt een minimaal invasieve methode beschreven voor het transplanteren en afbeelden van celtransplantaten in een adoptief overdrachtsmodel van diabetes bij muizen. In dit protocol worden cellen van de murine pancreas bètacellijn NIT-1 die de vuurvlieg luciferase transgen luc2 tot expressie brengt, subcutaan getransplanteerd in immunodeficiënte niet-obese diabetische (NOD) -ernstige gecombineerde immunodeficiënte (scid) muizen. Deze muizen worden tegelijkertijd intraveneus geïnjecteerd met splenocyten van spontaan diabetische NOD-muizen om auto-immuniteit over te dragen. De grafts worden met regelmatige tussenpozen in beeld gebracht via niet-invasieve bioluminescente beeldvorming om de celoverleving te volgen. De overleving van gemuteerde cellen wordt vergeleken met die van controlecellen die in dezelfde muis zijn getransplanteerd.
Type 1 diabetes (T1D) wordt veroorzaakt door de auto-immuunvernietiging van de insulineproducerende bètacellen van de alvleesklier. Het verlies van bètacelmassa resulteert in insulinedeficiëntie en hyperglycemie. T1D-patiënten vertrouwen op meerdere dagelijkse injecties met exogene insuline en ervaren episodes van ernstige hyperglykemie en hypoglykemie gedurende hun hele leven. De complicaties die verband houden met deze episodes omvatten diabetische retinopathie, verminderde nierfunctie en neuropathie1.
Insuline-injecties zijn een behandeling, maar geen remedie voor T1D. Het vervangen van de verloren bètacelmassa heeft echter het potentieel om de ziekte om te keren door patiënten in staat te stellen hun eigen insuline te produceren. Het aanbod van kadaverische donoreilandjes is echter beperkt2. Stamcel-afgeleide eilandjes (SC-eilandjes) kunnen een vrijwel onbeperkte voorraad bètacellen voor transplantatie bieden. Verschillende groepen hebben aangetoond dat menselijke embryonale stamcellen (SER’s) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC’s) kunnen worden gedifferentieerd om functionele bèta-achtige cellen te genereren 3,4,5. Veelbelovende vroege klinische onderzoeksgegevens geven aan dat deze cellen hun functie behouden na transplantatie en patiënten in staat kunnen stellen insulineonafhankelijk te worden6. Chronische immunosuppressie is echter vereist, waardoor hun gevoeligheid voor kanker en infectie toeneemt. Bovendien kunnen immunosuppressiva op lange termijn cytotoxisch zijn voor grafts7. Om de noodzaak van immunosuppressie te elimineren, kunnen SC-eilandjes genetisch worden gemodificeerd om ze te beschermen tegen terugkerende auto-immuniteit en allo-immuniteit na transplantatie.
Stamcelonderzoek is zeer veeleisend in kosten en arbeid. Muiscellijnen en diermodellen zijn nuttige hulpmiddelen voor de initiële identificatie en experimentele validatie van strategieën om getransplanteerde cellen te beschermen tegen auto-immuniteit. De NOD-muis ontwikkelt spontane auto-immuundiabetes met veel overeenkomsten met menselijke T1D8, en de NIT-1 insulinoomcellijn deelt een genetische achtergrond met deze muizenstam9. Diabetes kan adoptief worden overgedragen op de gerelateerde immunodeficiënte NOD-scid muizenstam via de injectie van diabetische splenocyten van NOD-muizen om het begin van diabetes tijdelijk te synchroniseren bij replicerende experimentele muizen10. Dit model kan worden gebruikt om genetische doelen relatief snel en goedkoop te identificeren voor verdere validatie in SC-eilandjes. Onlangs werd de methode toegepast om RNLS te identificeren en te valideren, een doelwit dat primaire menselijke eilandjes bleek te beschermen tegen auto-immuniteit in vivo en iPSC-afgeleide eilandjes tegen bètacelstress in vitro11. Hier wordt een eenvoudig protocol beschreven om genetisch gemanipuleerde NIT-1-cellen te transplanteren en niet-invasief hun overleving te controleren in een adoptief overdrachtsmodel van auto-immuundiabetes bij muizen.
T1D is een verwoestende ziekte waarvoor momenteel geen remedie bestaat. Bètacelvervangingstherapie biedt een veelbelovende behandeling voor patiënten met deze ziekte, maar de kritieke barrière voor deze strategie is het potentieel voor terugkerende auto-immuunaanvallen tegen de getransplanteerde bètacellen. De genetische manipulatie van SC-bètacellen om hun immuunzichtbaarheid of gevoeligheid te verminderen, is een mogelijke oplossing voor dit probleem. Hier wordt een protocol beschreven voor niet-invasieve beeldvor…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Dr. Erica P. Cai en Dr. Yuki Ishikawa voor het ontwikkelen van de methode beschreven in dit protocol (zie ref. 11). Onderzoek in de laboratoria van S.K. en P.Y. wordt ondersteund door subsidies van de National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, het Harvard Stem Cell Institute en de Beatson Foundation. T.S. werd ondersteund door een postdoctoraal fellowship van het National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45), en K.B. werd gedeeltelijk ondersteund door een fellowship van de Mary K. Iacocca Foundation.
0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
293FT | Invitrogen | R70007 | Fast-growing, highly transfectable clonal isolate derived from human embryonal kidney cells transformed with the SV40 large T antigen |
ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
Alcohol prep pads, 70% Isopropyl alcohol | Amazon/Ever Ready First Aid | B08NWF31DX | |
BD 5ml Syringe Luer-Lok Tip | BD | 309646 | |
BD PrecisionGlide Needle 26G x 5/8 (0.45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
BD 1 mL TB Syringe Slip Tip | BD | 309659 | |
Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
Cell strainer premium SureStrain, 70 µm, sterile | Southern Labware | C4070 | Or use similar sterile strainer with 40-70um pore size |
CellDrop automated cell counter | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Or use similar cell counter device |
Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile, Capacity=2 mL | VWR | 414004-265 | Or use similar aspirating pipette |
D-Luciferin, Potassium Salt , Molecular Biology Grade, Powder, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine | Gibco | 10313039 | |
Falcon BD tubes, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 10437-028 | |
Forceps premium for tissues, 1 x 2 teeth 5 in, German Steel | Fisher Scientific | 13-820-074 | |
Glucose urine test strip | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Or use similar test strip for glucose measurments in urine/blood |
GlutaMAX–1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
Infrared heating lamp | Cole Parmer | 03057-00 | Or use similar infrared lamp |
Insulin syringe 0.5 mL, U-100 29 G 0.5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
Isoflurane, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
IVIS Spectrum in vivo imaging system | Perkin Elmer | 124262 | Instrument for non-invasively collecting bioluminescent images of transplanted cells |
Living Image Analysis Software | Perkin Elmer | 128113 | Software for collecting and quantifying bioluminescent signal |
Microcentrifuge tubes seal-rite, 1.5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Or use similar sterile microcentrifuge tubes |
NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pancreatic beta-celll line derived from NOD/Lt mice |
NOD.Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mice homozygous for the severe combined immune deficiency spontaneous mutation Prkdcscid, commonly referred to as scid, are characterized by an absence of functional T cells and B cells, lymphopenia, hypogammaglobulinemia, and a normal hematopoietic microenvironment. |
NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | The NOD/ShiLtJ strain of mice (commonly called NOD) is a polygenic model for autoimmune type 1 diabetes |
PBS, pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | No calcium, no magnesium, no phenol red |
pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
pLenti-luciferase-blast | Made in-house | Plasmid available upon request | See Supplemental File 1 |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
Polyethylenimine, Linear, MW 25,000, Transfection Grade (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
Restrainer for rodents, broome-style round 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
Scissors, sharp-pointed | Fisher Scientific | 08-940 | Or use other scissors made of surgical-grade stainless steel |
Tissue-culture treated culture dishes | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Or use other sterile cell culture-treated Petri dishes |
Tweezers/Forceps, fine precision medium tipped | Fisher Scientific | 12-000-157 |