Een eenvoudig protocol voor het in kaart brengen van de eigenschappen van de plantwortelsysteemarchitectuur
Summary
We gebruiken eenvoudige laboratoriumtools om de wortelsysteemarchitectuur (RSA) van Arabidopsis en Medicago te onderzoeken. De plantjes worden hydroponisch over gaas gekweekt en verspreid met behulp van een kunstkwast om de RSA te onthullen. Foto’s worden gemaakt met behulp van scannen of een camera met hoge resolutie en vervolgens geanalyseerd met ImageJ om eigenschappen in kaart te brengen.
Abstract
Uitgebreide kennis van de ontwikkeling van de plant root system architecture (RSA) is van cruciaal belang voor het verbeteren van de efficiëntie van het gebruik van voedingsstoffen en het verhogen van de tolerantie van gewascultivar voor milieu-uitdagingen. Een experimenteel protocol wordt gepresenteerd voor het opzetten van het hydrocultuursysteem, plantjesgroei, RSA-verspreiding en beeldvorming. De aanpak maakte gebruik van een magenta box-gebaseerd hydroponisch systeem met polypropyleen gaas ondersteund door polycarbonaat wiggen. Experimentele omgevingen worden geïllustreerd door de RSA van de plantjes te beoordelen onder variërende voedingsstof (fosfaat [Pi]) toevoer. Het systeem is opgezet om de RSA van Arabidopsis te onderzoeken, maar het is gemakkelijk aan te passen om andere planten zoals Medicago sativa (Alfalfa) te bestuderen. Arabidopsis thaliana (Col-0) plantjes worden in dit onderzoek gebruikt als voorbeeld om de plant RSA te begrijpen. Zaden worden aan het oppervlak gesteriliseerd door ethanol en verdund commercieel bleekmiddel te behandelen en op 4 °C te houden voor stratificatie. De zaden worden ontkiemd en gekweekt op een vloeibaar half-MS medium op een polypropyleen gaas ondersteund door polycarbonaat wiggen. De plantjes worden gekweekt onder standaard groeiomstandigheden voor het gewenste aantal dagen, voorzichtig uit het gaas geplukt en ondergedompeld in waterhoudende agarplaten. Elk wortelstelsel van de plantjes wordt zachtjes op de met water gevulde plaat verspreid met behulp van een ronde kunstkwast. Deze petriplaten worden gefotografeerd of gescand met hoge resolutie om de RSA-eigenschappen te documenteren. De wortelkenmerken, zoals primaire wortel, laterale wortels en vertakkingszone, worden gemeten met behulp van de vrij beschikbare ImageJ-software. Deze studie biedt technieken voor het meten van plantwortelkenmerken in gecontroleerde omgevingsomgevingen. We bespreken hoe we (1) de plantjes kunnen laten groeien en wortelmonsters kunnen verzamelen en verspreiden, (2) foto’s van verspreide RSA-monsters kunnen verkrijgen, (3) de afbeeldingen kunnen vastleggen en (4) beeldanalysesoftware kunnen gebruiken om wortelkenmerken te kwantificeren. Het voordeel van de huidige methode is de veelzijdige, eenvoudige en efficiënte meting van de RSA-eigenschappen.
Introduction
De wortelsysteemarchitectuur (RSA), die ondergronds is, is een vitaal orgaan voor plantengroei en productiviteit 1,2,3. Na het embryonale stadium ondergaan planten hun belangrijkste morfologische veranderingen. De manier waarop de wortels in de grond groeien, heeft grote invloed op de groei van plantendelen boven de grond. Wortelgroei is de eerste stap in ontkieming. Het is een informatieve eigenschap omdat het op unieke wijze reageert op verschillende beschikbare voedingsstoffen 1,2,3,4. De RSA vertoont een hoge mate van ontwikkelingsplasticiteit, wat betekent dat de omgeving altijd wordt gebruikt om beslissingen te nemen over ontwikkeling 2,5. Veranderingen in de omgeving hebben de productie van gewassen in het huidige scenario bemoeilijkt. Op continue basis neemt de RSA omgevingssignalen mee in ontwikkelingskeuzes5. Als gevolg hiervan is een grondig begrip van de principes achter wortelontwikkeling essentieel om te leren hoe planten reageren op veranderende omgevingen 2,5.
De RSA detecteert variërende nutriëntenconcentraties en geeft fenotypische veranderingen 4,6,7,8,9,10,11,12. Studies suggereren dat wortelmorfologie /RSA zeer plastisch is in vergelijking met scheutmorfologie 1,3. RSA trait mapping is zeer effectief in het vastleggen van het effect van het veranderen van de omringende bodemomgeving 1,11,12.
Over het algemeen zijn discrepanties in het effect van verschillende tekorten aan voedingsstoffen op het wortelfenotype gemeld in veel eerdere studies 3,11,13,14,15. Er zijn bijvoorbeeld verschillende contrasterende rapporten over fosfaat (Pi) door uithongering veroorzaakte veranderingen in het aantal, de lengte en de dichtheid van laterale wortels (LRs). Een toename van de LR-dichtheid is gemeld onder de Pi-deficiënte toestand 6,8. Daarentegen is een afname van de LR-dichtheid onder Pi-deficiënte omstandigheden ook gemeld door andere auteurs 3,13,16. Een van de prominente oorzaken van deze inconsistenties is het gebruik van het elementaire contaminatiegevoelige geleermedium, dat agar vaak10 bevat. Onderzoekers kweken hun experimentele planten meestal op een op agar gebaseerd plaatsysteem en registreren de wortelkenmerken. Talrijke RSA-eigenschappen zijn vaak verborgen of verankerd in het agarmateriaal en kunnen niet worden gedocumenteerd. Experimenten die verband houden met het induceren van tekort aan voedingsstoffen, waarbij gebruikers vaak één component volledig uitsluiten van het medium, kunnen niet worden uitgevoerd in elementair contaminatiegevoelig geleermedium11,14,15. Talrijke voedingsstoffen zijn vaak aanwezig in aanzienlijke hoeveelheden in de agar media, waaronder P, Zn, Fe, en nog veel meer11,14,15. Bovendien is de RSA-groei langzamer in op agar gebaseerde media dan in vloeibaar medium dat niet op agar is gebaseerd. Als gevolg hiervan is er behoefte aan een alternatieve, niet-agar-gebaseerde benadering voor het kwantificeren en kwalitatief registreren van het fenotype van RSA. Daarom is de huidige methode ontwikkeld, waarbij plantlets worden grootgebracht in een magenta box-gebaseerd hydroponisch systeem bovenop een polypropyleen gaas ondersteund door polycarbonaat wiggen 1,10,11.
Deze studie presenteert een gedetailleerde geïmproviseerde versie van de eerdere methode beschreven door Jain et al.10. Deze strategie is afgestemd op de huidige eisen in de biologie van plantenwortels en kan ook worden gebruikt voor planten zoals Alfalfa, anders dan modelplanten. Het protocol is de primaire manier om de veranderingen in RSA te meten en vereist alleen eenvoudige apparatuur. Het huidige protocol illustreert hoe verschillende wortelkenmerken kunnen worden fenotypeerd, zoals primaire en laterale wortels in normaal en gemodificeerd medium (Pi-deficiënt). Stapsgewijze aanwijzingen en andere nuttige tips uit de ervaringen van de auteur worden gegeven om de onderzoekers te helpen de methodologieën te volgen die in deze methode worden aangeboden. De huidige studie heeft tot doel een eenvoudige en effectieve methode te bieden voor het onthullen van het hele wortelstelsel van planten, inclusief LRs van hogere orde. Deze methode omvat het handmatig verspreiden van het wortelstelsel met een ronde aquarel art penseel, waardoor nauwkeurige controle over de blootstelling vande wortels 1,10,11,12. Het vereist geen dure apparatuur of ingewikkelde software. Deze methode heeft de opname en groeisnelheid van voedingsstoffen verbeterd; Planten hebben een voedingsrijke oplossing die gemakkelijk door hun wortels wordt opgenomen. De huidige methode is geschikt voor onderzoekers die de eigenschappen van het wortelstelsel van een plant in detail in kaart willen brengen, met name tijdens de vroege ontwikkeling (10-15 dagen na ontkieming). Het is geschikt voor kleine wortelstelsels, modelplanten zoals Arabidopsis en tabak, en niet-conventionele planten zoals Alfalfa totdat hun wortelstelsel in de magenta-dozen past.
De stappen voor fenotypische analyse van RSA-ontwikkeling in Arabidopsis worden in dit protocol als volgt beschreven: (1) de methode van sterilisatie van het zaadoppervlak voor planten (Arabidopsis), (2) de stappen om het hydroponische systeem op te zetten, gevolgd door zaadzaaien op een medium, (3) procedure voor het verwijderen van de volledige zaailingen en het verspreiden op de petriplaat voor RSA-analyse, (4) hoe de beelden voor RSA op te nemen en (5) belangrijke RSA-parameters te berekenen met behulp van ImageJ-software.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk demonstreerde het in kaart brengen van RSA met behulp van eenvoudige laboratoriumapparatuur. Met behulp van deze methode worden fenotypische veranderingen op het verfijnde niveau geregistreerd. Het voordeel van deze strategie is dat het scheutgedeelte nooit in contact komt met de media, dus het fenotype van de plantjes is origineel. Deze methode omvat het opzetten van een hydroponisch systeem om planten te laten groeien zoals beschreven in het protocol. Vervolgens wordt elk plantje er intact uitgehaald en op een…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We erkennen het Amerikaanse ministerie van Landbouw (Grant 58-6406-1-017) voor het ondersteunen van dit onderzoek. We erkennen ook het WKU Biotechnology Centre, Western Kentucky University, Bowling Green, KY, VS, en de directeur, CSIR Central Institute of Medicinal and Aromatic Plants, Lucknow, India, voor het leveren van de instrumentfaciliteiten en ondersteuning (CSIR CIMAP manuscript communicatie nr. CIMAP / PUB / 2022/103). SS erkent de financiële steun van Saint Joseph’s University, Philadelphia, VS.
Materials
| Arabidospsis thaliana (Col 0) | Lehle Seeds | WT-02 | Columbia (Col-0**, no markers)* |
| Art brushes | Amazon or any other vendor | Water color round brush size no. 14 (8 mm), 16 (9.5 mm), 18 (12 mm), and 20 (14.2 mm) | |
| Automated Microscope with digital camera | Leica Microsystems | LAS version 4.12.0, Leica Microsystems | |
| Imaging Software | ImageJ | ImageJ V 1.8.0 |
|
| Magenta box GA-7 | Fisher Scientific | 50-255-176 | |
| Medicago sativa | Johnny's Seeds | ||
| Petri-plate (150 mm x 15 mm) | USA Scientific | 8609-0215 | 150 mm x 15 mm PS Petri Dish (https://www.usascientific.com) |
| Photo camera | Cannon or Nikon | Any high mega pixel (atleast 12 mega pixel per inch) camera on macro mode | |
| Plant-Agar | Sigma-Aldrich | A3301 | Agargel Suitable for plant tissue culture |
| Polycarbonate Sheets | Amazon | 1 mm thick | |
| Polypropylene Mesh | Amazon | Pore size 250 µm, 500 µm and 1000 µm | |
| Scanner | Epson | Epson Perfection V700 Photo (Scan at 600 dpi) |
References
- Shukla, D., Rinehart, C. A., Sahi, S. V. Comprehensive study of excess phosphate response reveals ethylene mediated signaling that negatively regulates plant growth and development. Scientific Reports. 7 (1), 3074 (2017).
- Rellán-Álvarez, R., Lobet, G., Dinneny, J. R. Environmental control of root system biology. Annual Review of Plant Biology. 67, 619-642 (2016).
- Gruber, B. D., Giehl, R. F. H., Friedel, S., von Wirén, N. Plasticity of the Arabidopsis root system under nutrient deficiencies. Plant Physiology. 163 (1), 161-179 (2013).
- Shukla, D., et al. Genome-wide expression analysis reveals contrasting regulation of phosphate starvation response (PSR) in root and shoot of Arabidopsis and its association with biotic stress. Environmental and Experimental Botany. , 188 (2021).
- Robbins 2nd, ., E, N., Dinneny, J. R. Growth is required for perception of water availability to pattern root branches in plants. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), E822-E831 (2018).
- Linkohr, B. I., Williamson, L. C., Fitter, A. H., Leyser, H. M. O. Nitrate and phosphate availability and distribution have different effects on root system architecture of Arabidopsis. The Plant Journal. 29 (6), 751-760 (2002).
- Lynch, J. P., Brown, K. M. Topsoil foraging: an architectural adaptation of plants to low phosphorus availability. Plant and Soil. 237 (2), 225-237 (2001).
- López-Bucio, J., et al. Phosphate availability alters architecture and causes changes in hormone sensitivity in the Arabidopsis root system. Plant Physiology. 129 (1), 244-256 (2002).
- Jain, A., et al. Differential effects of sucrose and auxin on localized phosphate deficiency-induced modulation of different traits of root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 144 (1), 232-247 (2007).
- Jain, A., et al. Variations in the composition of gelling agents affect morphophysiological and molecular responses to deficiencies of phosphate and other nutrients. Plant Physiology. 150 (2), 1033-1049 (2009).
- Jain, A., Sinilal, B., Dhandapani, G., Meagher, R. B., Sahi, S. V. Effects of deficiency and excess of zinc on morphophysiological traits and spatiotemporal regulation of zinc-responsive genes reveal incidence of cross talk between micro- and macronutrients. Environmental Science and Technology. 47 (10), 5327-5335 (2013).
- Jain, A., et al. Role of Fe-responsive genes in bioreduction and transport of ionic gold to roots of Arabidopsis thaliana during synthesis of gold nanoparticles. Plant Physiology and Biochemistry. 84, 189-196 (2014).
- Williamson, L. C., Ribrioux, S. P., Fitter, A. H., Leyser, H. M. Phosphate availability regulates root system architecture in Arabidopsis. Plant Physiology. 126 (2), 875-882 (2001).
- Yang, T. J. W., Lin, W. D., Schmidt, W. Transcriptional profiling of the Arabidopsis iron deficiency response reveals conserved transition metal homeostasis networks. Plant Physiology. 152 (4), 2130 (2010).
- Kobae, Y., et al. Zinc transporter of Arabidopsis thaliana AtMTP1 is localized to vacuolar membranes and implicated in zinc homeostasis. Plant Cell and Physiology. 45 (12), (2004).
- Al-Ghazi, Y., et al. Temporal responses of Arabidopsis root architecture to phosphate starvation: evidence for the involvement of auxin signalling. Plant, Cell and Environment. 26 (7), 1053-1066 (2003).
- S, U. . National Institutes of Health. , 1997-2007 (1997).
- Dubrovsky, J. G., Forde, B. G. Quantitative analysis of lateral root development: pitfalls and how to avoid them. The Plant Cell. 24 (1), 4-14 (2012).
- Weeks, J. T., Ye, J., Rommens, C. M. Development of an in planta method for transformation of Alfalfa (Medicago sativa). Transgenic Research. 17 (4), 587-597 (2008).
- Shukla, D., Krishnamurthy, S., Sahi, S. V. Microarray analysis of Arabidopsis under gold exposure to identify putative genes involved in the synthesis of gold nanoparticles (AuNPs).Genomics Data. 3, 100-102 (2015).
