Summary

تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا من خلال التعلم الخاضع للإشراف بالمحاكاة

Published: March 03, 2023
doi:

Summary

تشرح هذه المقالة كيفية استخدام التعلم الآلي تحت إشراف المحاكاة لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا في صور الفحص المجهري الفلوري للخلايا الثابتة.

Abstract

يعد التحليل الكمي للعضيات تحت الخلوية مثل الميتوكوندريا في صور الفحص المجهري الفلوري للخلايا مهمة شاقة بسبب التحديات الكامنة في تجزئة هذه الهياكل الصغيرة والمتنوعة شكليا. في هذه المقالة ، نوضح استخدام خط أنابيب التجزئة والتحليل بمساعدة التعلم الآلي للقياس الكمي لمورفولوجيا الميتوكوندريا في صور الفحص المجهري الفلوري للخلايا الثابتة. يتم تدريب أداة التجزئة القائمة على التعلم العميق على الصور المحاكية وتلغي الحاجة إلى التعليقات التوضيحية للحقيقة الأرضية للتعلم العميق الخاضع للإشراف. نوضح فائدة هذه الأداة في صور الفحص المجهري الفلوري للخلايا العضلية القلبية الثابتة مع تعبير مستقر عن علامات الميتوكوندريا الفلورية ونستخدم ظروفا محددة لزراعة الخلايا لإحداث تغييرات في مورفولوجيا الميتوكوندريا.

Introduction

في هذه الورقة ، نوضح فائدة أداة التعلم الآلي القائمة على الفيزياء للتجزئة تحت الخلوية1 في صور الفحص المجهري الفلوري للخلايا العضلية القلبية الثابتة التي تعبر عن علامات الميتوكوندريا الفلورية.

الميتوكوندريا هي العضيات الرئيسية المنتجة للطاقة في خلايا الثدييات. على وجه التحديد ، الميتوكوندريا هي عضيات ديناميكية للغاية وغالبا ما توجد في الشبكات التي تتغير باستمرار في الطول والتفرع. يؤثر شكل الميتوكوندريا على وظيفتها ، ويمكن للخلايا تغيير مورفولوجيا الميتوكوندريا بسرعة للتكيف مع التغير في البيئة2. لفهم هذه الظاهرة ، فإن التصنيف المورفولوجي للميتوكوندريا كنقاط أو قضبان أو شبكات مفيد للغاية3.

تجزئة الميتوكوندريا أمر بالغ الأهمية لتحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا في الخلايا. تعتمد الطرق الحالية لتقسيم وتحليل صور الفحص المجهري الفلوري للميتوكوندريا على التجزئة اليدوية أو مناهج معالجة الصور التقليدية. الأساليب القائمة على العتبة مثل Otsu4 أقل دقة بسبب مستويات الضوضاء العالية في صور الفحص المجهري. عادة ، تتميز صور التحليل المورفولوجي للميتوكوندريا بعدد كبير من الميتوكوندريا ، مما يجعل التجزئة اليدوية مملة. الأساليب الرياضية مثل MorphoLibJ5 وأساليب التعلم الآلي شبه الخاضعة للإشراف مثل Weka6 تتطلب الكثير من المتطلبات وتتطلب معرفة الخبراء. أظهرت مراجعة تقنيات تحليل الصور للميتوكوندريا7 أن التقنيات القائمة على التعلم العميق قد تكون مفيدة لهذه المهمة. في الواقع ، تم إحداث ثورة في تجزئة الصور في صور الحياة اليومية لتطبيقات مثل القيادة الذاتية باستخدام النماذج القائمة على التعلم العميق.

التعلم العميق هو مجموعة فرعية من التعلم الآلي توفر خوارزميات تتعلم من كميات كبيرة من البيانات. تتعلم خوارزميات التعلم العميق الخاضعة للإشراف العلاقات من مجموعات كبيرة من الصور المشروحة بتسميات الحقيقة الأرضية (GT) الخاصة بها. التحديات في استخدام التعلم العميق الخاضع للإشراف لتقسيم الميتوكوندريا في صور الفحص المجهري الفلوري ذات شقين. أولا ، يتطلب التعلم العميق الخاضع للإشراف مجموعة بيانات كبيرة من صور التدريب ، وفي حالة الفحص المجهري الفلوري ، سيكون توفير مجموعة البيانات الكبيرة هذه مهمة واسعة النطاق مقارنة باستخدام الصور التقليدية القائمة على الكاميرا المتاحة بسهولة أكبر. ثانيا ، تتطلب صور الفحص المجهري الفلوري تعليقات GT للكائنات ذات الأهمية في صور التدريب ، وهي مهمة شاقة تتطلب معرفة متخصصة. يمكن أن تستغرق هذه المهمة بسهولة ساعات أو أياما من وقت الخبير للحصول على صورة واحدة للخلايا ذات الهياكل تحت الخلوية ذات العلامات الفلورية. علاوة على ذلك ، تشكل الاختلافات بين المعلقين مشكلة. لإزالة الحاجة إلى التعليق التوضيحي اليدوي ، ولتكون قادرا على الاستفادة من الأداء المتفوق لتقنيات التعلم العميق ، تم استخدام نموذج تجزئة قائم على التعلم العميق هنا تم تدريبه على الصور المحاكاة. توفر أجهزة المحاكاة القائمة على الفيزياء طريقة لتقليد عملية تكوين الصورة والتحكم فيها في المجهر ، مما يسمح بإنشاء صور لأشكال معروفة. باستخدام جهاز محاكاة قائم على الفيزياء ، تم إنشاء مجموعة بيانات كبيرة من صور الفحص المجهري الفلوري المحاكية للميتوكوندريا لهذا الغرض.

تبدأ المحاكاة بتوليد الهندسة باستخدام منحنيات حدودية لتوليد الشكل. يتم وضع البواعث بشكل عشوائي على سطح الشكل بطريقة موزعة بشكل موحد بحيث تتطابق الكثافة مع القيم التجريبية. يتم حساب دالة انتشار نقطة 3D (PSF) للمجهر باستخدام تقريب فعال حسابيا8 من نموذج جيبسون-لاني9. لمطابقة الصور المحاكية بشكل وثيق مع الصور التجريبية ، يتم محاكاة كل من التيار المظلم وضوضاء اللقطة لتحقيق واقعية الصورة. يتم إنشاء GT المادية في شكل خريطة ثنائية. يتوفر رمز إنشاء مجموعة البيانات وتدريب نموذج المحاكاة10 ، وخطوة إنشاء مجموعة البيانات المحاكاة هذه موضحة في الشكل 1.

نعرض فائدة التجزئة القائمة على التعلم العميق المدربة بالكامل على مجموعة بيانات محاكاة من خلال تحليل صور الفحص المجهري متحد البؤر لأرومات عضلة القلب الثابتة. عبرت هذه الأرومات العضلية القلبية عن علامة فلورية في الغشاء الخارجي للميتوكوندريا ، مما يسمح بتصور الميتوكوندريا في صور الفحص المجهري الفلوري. قبل إجراء التجربة المعطاة كمثال هنا ، حرمت الخلايا من الجلوكوز وتكيفت مع الجالاكتوز لمدة 7 أيام في الثقافة. إن استبدال الجلوكوز في وسائط النمو بالجالاكتوز يجبر الخلايا في الثقافة على أن تصبح أكثر أكسدة ، وبالتالي تعتمد على الميتوكوندريا لإنتاج الطاقة11,12. علاوة على ذلك ، فإن هذا يجعل الخلايا أكثر حساسية لتلف الميتوكوندريا. يمكن إحداث تغييرات مورفولوجيا الميتوكوندريا تجريبيا عن طريق إضافة عامل فك ارتباط الميتوكوندريا مثل سيانيد الكربونيل m-chlorophenyl hydrazone (CCCP) إلى وسط زراعة الخلية13. يؤدي CCCP إلى فقدان إمكانات غشاء الميتوكوندريا (ΔΨm) ، وبالتالي يؤدي إلى تغييرات في الميتوكوندريا من مورفولوجيا أكثر أنبوبية (تشبه القضيب) إلى مورفولوجيا أكثر كروية (تشبه النقطة)14. بالإضافة إلى ذلك ، تميل الميتوكوندريا إلى الانتفاخ أثناء علاج CCCP15. نعرض التوزيع المورفولوجي لتغيرات الميتوكوندريا عندما تم علاج الخلايا العضلية القلبية المتكيفة مع الجالاكتوز باستخدام CCCP غير المرتبطين بالميتوكوندريا. مكنتنا أجزاء التعلم العميق للميتوكوندريا من تصنيفها على أنها نقاط أو قضبان أو شبكات. ثم اشتقنا مقاييس كمية لتقييم أطوال الفروع ووفرة الأنماط الظاهرية المختلفة للميتوكوندريا. تم توضيح خطوات التحليل في الشكل 2 ، وترد أدناه تفاصيل ثقافة الخلية ، والتصوير ، وإنشاء مجموعة البيانات للتجزئة القائمة على التعلم العميق ، بالإضافة إلى التحليل الكمي للميتوكوندريا.

Protocol

ملاحظة: يمكن حذف الأقسام 1-4 في حالة العمل مع صور الفحص المجهري الموجودة للميتوكوندريا ذات الظروف التجريبية المعروفة. 1. ثقافة الخلية قم بزراعة خلايا H9c2 في DMEM بدون جلوكوز مكمل ب 2 mM L-glutamine ، 1 mM بيروفات الصوديوم ، 10 mM الجالاكتوز ، 10٪ FBS ، 1٪ الستربتومايسين / البنسلين ، و 1 ميكروغرام / مل بوروميسين. اسمح للخلايا بالتكيف مع الجالاكتوز لمدة 7 أيام على الأقل في الثقافة قبل التجارب.ملاحظة: تم تعديل خلايا H9c2 المستخدمة هنا وراثيا للتعبير عن الميتوكوندريا الفلورية واكتسبت أيضا جين مقاومة البوروميسين. تضمن إضافة هذا المضاد الحيوي نمو الخلايا مع جين المقاومة ، وبالتالي الميتوكوندريا الفلورية. قم بزرع خلايا H9c2 للتجربة عندما يصل التقاء الخلية إلى حوالي 80٪ (دورق ثقافة T75 ، تم تقييمه بواسطة الفحص المجهري برايتفيلد). سخني الوسط مسبقا والتريبسين إلى 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل المتابعة.ملاحظة: من الممكن إجراء التجربة بالتوازي مع حالتين مختلفتين أو أكثر من حالات زراعة الخلايا. يجب ألا يزيد التقاء الخلايا H9c2 عن 80٪ لمنع فقدان الخلايا الأرومية العضلية. عند التقاء 100٪ ، تشكل الخلايا الأنابيب العضلية وتبدأ في التمايز. استعد لبذر الخلايا ، التي تعمل في غطاء تدفق رقائقي معقم ، عن طريق وضع غطاء زجاجي # 1.5 لكل حالة تجريبية في بئر من لوحة 12 بئر. قم بتسمية كل حالة والتفاصيل التجريبية على لوحة 12 بئرا. انقل قارورة ثقافة الخلية من الحاضنة إلى سطح العمل في الغطاء. قم بشفط الوسط باستخدام نظام شفط أو ماصة إلكترونية ، ثم اغسله مرتين باستخدام 5 مل من PBS (درجة حرارة الغرفة). انقل التربسين المسخن مسبقا إلى سطح العمل ، واستنشق غسل PBS النهائي ؛ ثم أضف التربسين المسخن مسبقا لفصل الخلايا (1 مل لقارورة ثقافة T75). ضع قارورة الثقافة مرة أخرى في الحاضنة لمدة 2-3 دقائق عند 37 درجة مئوية. انقل الوسط المسخن مسبقا إلى سطح العمل في نهاية الحضانة. تحقق من انفصال الخلايا باستخدام مجهر برايتفيلد.إذا لم تنفصل جميع الخلايا ، ضع عدة نقرات دقيقة ولكن ثابتة على جانب القارورة لفصل الخلايا المتبقية. أعد قارورة الثقافة إلى سطح العمل. أضف 4 مل من وسط زراعة الخلايا إلى دورق المزرعة باستخدام ماصة إلكترونية لإيقاف عمل التربسين. عند إضافة وسط الاستزراع إلى القارورة ، استخدم الماصة لتفريق الوسط بشكل متكرر عبر السطح لفصل الخلايا وتجميعها في معلق خلوي. ماصة تعليق الخلية (5 مل) من القارورة إلى أنبوب 15 مل. أجهزة الطرد المركزي للخلايا في 200 × ز لمدة 5 دقائق. افتح الأنبوب الموجود في الغطاء ، وقم بإزالة المادة الطافية عن طريق الشفط ، وأعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 5 مل من وسائط زراعة الخلية. قم بتقييم عدد الخلايا عن طريق تحليل حجم صغير من معلق الخلية في عداد الخلايا الآلي. لاحظ عدد الخلايا الحية لكل ملليلتر من وسائط الثقافة. انقل الحجم المطلوب (على سبيل المثال ، 150 ميكرولتر لكل بئر) من معلق الخلية ، محسوبا لكثافة البذر التي تبلغ حوالي 2 × 104 خلايا / سم2 ، إلى أنبوب طرد مركزي 15 مل محدد مسبقا. أضف وسط زراعة الخلايا المسخن مسبقا إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 15 مل بحجم محسوب مسبقا بناء على عدد الآبار. بالنسبة لألواح 12 بئرا ، استخدم حجما إجماليا قدره 1 مل لكل بئر. تأكد من خلط تعليق الخلية المخفف بشكل صحيح عن طريق سحب محتويات أنبوب الطرد المركزي لأعلى ولأسفل عدة مرات قبل توزيع الحجم المناسب لكل بئر. بمجرد توزيع تعليق الخلية في البئر ، هز اللوحة بطريقة يتم التحكم فيها بعناية في كل اتجاه لتوزيع الخلايا بشكل أفضل في جميع أنحاء الآبار. ضع الصفيحة المكونة من 12 بئرا في الحاضنة عند 37 درجة مئوية حتى اليوم التالي. تحقق من الخلايا باستخدام مجهر برايتفيلد لتقييم النمو. إذا حققت الخلايا نموا كافيا إلى ما يقرب من 80٪ من الالتقاء ، فانتقل إلى الخطوات التالية ؛ خلاف ذلك ، كرر التقييم يوميا حتى يتم الوصول إلى نمو كاف. 2. الإجراء التجريبي احسب الكميات اللازمة من المواد للتجربة وفقا لتركيزات محلول المخزون. قم بإذابة المواد المجمدة (محلول مخزون CCCP 30 mM) عند 37 درجة مئوية ، واضبط وسط زراعة الخلية على التسخين المسبق عند 37 درجة مئوية. بمجرد إذابة الجليد ، قم بإنشاء محلول عمل من 10 ميكرومتر CCCP عن طريق تخفيف محلول المخزون (1: 3000) في وسط زراعة الخلية.ملاحظة: لا تقل أحجام الماصة عن 1 ميكرولتر. ابدأ العلاجات التجريبية بمجرد تحضير جميع المواد اللازمة وتسخينها مسبقا. قم بشفط وسط استزراع الخلية من آبار الصفيحة المكونة من 12 بئرا ، ثم قم بتطبيق الوسط الطازج المسخن مسبقا بسرعة على آبار التحكم والوسط المسخن مسبقا بمحلول CCCP 10 ميكرومتر على آبار حالة الاختبار. احتضان لوحة 12 بئر في حاضنة الخلايا 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. خلال فترة الحضانة ، قم بإعداد حل التثبيت. لإعداد محلول التثبيت ، استخدم محلول بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) المصنوع مسبقا لتخفيف محلول مخزون الجلوتارالدهيد (GA) بنسبة 25٪ إلى 0.2٪ (1: 125). اضبط المحلول على التسخين المسبق عند 37 درجة مئوية. بالنسبة للوحة ذات 12 بئرا ، يكفي 500 ميكرولتر لكل بئر.تنبيه: PFA و GA مواد كيميائية سامة. العمل في غطاء كيميائي مع معدات واقية. انظر SDS الخاصة بهم للحصول على التفاصيل. عند اكتمال فترة الحضانة ، قم بإزالة اللوحة المكونة من 12 بئرا من الحاضنة ، وضعها على سطح العمل.ملاحظة: لم يعد العمل يتطلب بيئة معقمة. قم بشفط وسط زراعة الخلايا من الآبار ، وقم بتطبيق محلول التثبيت المسخن مسبقا. أعد اللوحة المكونة من 12 بئرا إلى الحاضنة التي تبلغ درجة حرارتها 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. قم بشفط محلول التثبيت عند الانتهاء من الحضانة ، واغسل كل بئر مرتين باستخدام PBS بدرجة حرارة الغرفة. من الممكن إيقاف التجربة مؤقتا في هذه المرحلة من البروتوكول والمتابعة لاحقا.إذا تم إيقاف التجربة مؤقتا ، أضف 1 مل من PBS لكل بئر ، وأغلق اللوحة المكونة من 12 بئرا بغشاء بلاستيكي (بارافيلم) ، وقم بتخزينها عند 4 درجات مئوية. 3. تلطيخ وتركيب الخلايا على أغطية الغطاء قم بإذابة مخزون DAPI (البقع النووية) ، وقم بتدويره في جهاز طرد مركزي صغير قبل الفتح. قم بإعداد محلول تلطيخ DAPI عن طريق تخفيف مخزون DAPI في PBS (1: 1,000). قم بشفط PBS من لوحة 12 بئرا ، وقم بتطبيق 1 مل من محلول تلطيخ DAPI على كل بئر. احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. نضح محلول تلطيخ DAPI. اغسل مرتين مع 2 مل من PBS لكل بئر. قم بإعداد شرائح مجهر زجاجية بلورية (شرائح زجاجية) عن طريق غسلها في 70٪ من الإيثانول ، تليها ثلاث غسلات في برنامج تلفزيوني. جفف الشرائح بعناية باستخدام مناشف ورقية خالية من النسالة ، ووجهها نحو الضوء للتحقق من وجود علامات الغبار أو الشحوم.ملاحظة: القفازات مطلوبة لهذه الخطوة. قم بتسمية الشرائح الزجاجية بالتفاصيل التجريبية. انقل وسيط التركيب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق ، وقم بتدويره في جهاز طرد مركزي صغير. استعد لتركيب أغطية الغطاء عن طريق ترتيب مساحة العمل. احتفظ بلوحة من 12 بئرا مع أغطية ، وشرائح زجاجية ذات علامات ، ووسيط تركيب ، وماصة ، وأطراف ماصة 10 ميكرولتر ، ومناشف ورقية خالية من النسالة ، وملاقط جاهزة. ضع 10 ميكرولتر من وسيط التركيب (ProLong Glass) على شريحة زجاجية معدة لتركيب غطاء غطاء. التقط غطاء الغطاء من اللوحة المكونة من 12 بئرا باستخدام ملاقط ، وامسح الرطوبة من غطاء الغطاء عن طريق لمس حافة وظهر الغطاء لفترة وجيزة بالمنشفة الورقية المعدة الخالية من النسالة. اخفض الغطاء برفق لأسفل على قطرة وسط التركيب. كرر الخطوتين المذكورتين أعلاه لكل قسيمة غطاء. ضع قطرات متوسطة التركيب للسماح بما بين واحد وأربعة أغطية لكل شريحة زجاجية. تأكد من أن الشرائح الزجاجية على سطح مستو لتجنب تحريك أغطية الغطاء المركبة. ضع الشرائح الزجاجية في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة طوال الليل للسماح لوسيط التثبيت بالضبط. العينات جاهزة الآن للتصوير. يمكن إيقاف التجربة مؤقتا في هذه المرحلة من البروتوكول ومتابعتها لاحقا. إذا تم إيقاف التجربة مؤقتا في هذه المرحلة ، فبعد السماح للعينات بالتثبيت طوال الليل في درجة حرارة الغرفة ، قم بتغطيتها بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء ، وقم بتخزينها في 4 درجات مئوية. 4. الفحص المجهري والتصوير قم بتغطية العينات بورق الألمنيوم للنقل (إن لم يكن قد تم بالفعل). عند الوصول إلى مرفق الفحص المجهري ، استخدمH2O المقطر المزدوج مع ورق ترشيح المجهر لتنظيف بقايا PBS من أغطية الأغطية على الشرائح الزجاجية. تأكد من عدم وجود بقع على أغطية الغطاء عن طريق الضغط على الشرائح الزجاجية باتجاه الضوء الساطع. انتقل من خلال إجراء بدء التشغيل للمجهر. حدد الهدف المناسب (Plan-Apochromat 63x / 1.40 Oil M27) ، وأضف وسيط الغمر. ضع العينة في حامل العينة. ضمن برنامج المجهر ، استخدم علامة التبويب “تحديد الموقع” لتنشيط إضاءة مضان EGFP ، وباستخدام المنظار ، اضبط مستوى z يدويا لتركيز العينة. قم بإيقاف تشغيل الإضاءة الفلورية عند العثور على التركيز. قم بالتبديل إلى علامة التبويب “اكتساب” داخل برنامج المجهر. استخدم “الإعداد الذكي” لتحديد قنوات التألق لاستخدامها في التصوير. لهذه التجربة ، تم اختيار الإعدادات المسبقة لقناة EGFP و DAPI. اضبط شدة كل قناة من الإعدادات الأولية باستخدام الرسم البياني للشدة كدليل لتحسين قوة الإشارة. يمكن أن يبدأ التصوير الآن. للتصوير ، استخدم خيار البرنامج لوضع مواضع التصوير في صفيف ، وتوسيط المصفوفة في منتصف غطاء الغطاء بإجمالي 12 موضعا ليتم تصويرها. تحقق من أن كل موضع في الصفيف يحتوي على خلايا. إذا لم تكن هناك خلايا ، فاضبط الموضع على منطقة بها خلايا. اضبط تركيز كل موضع في المصفوفة باستخدام التركيز التلقائي لبرنامج المجهر ، واتبع ذلك بضبط دقيق يدوي لضمان تركيز أكبر عدد ممكن من الميتوكوندريا.ملاحظة: يتم استخدام قناة EGFP لهذه التعديلات اليدوية. احصل على الصور باستخدام هذه الطريقة لكل قسيمة غطاء. احفظ ملفات الصور ، وانتقل إلى خطوات التحليل المورفولوجي. 5. توليد بيانات التدريب المحاكاة قم بتنزيل الرمز10 ، وقم بفك ضغط المحتويات. اتبع الإرشادات الواردة في README.md لإعداد البيئة المطلوبة. انتقل إلى المجلد المسمى “src” ، وهو المجلد الرئيسي لهذا المشروع. تحتوي المجلدات المرقمة بالداخل على رموز خاصة بخطوات مختلفة لاستخدام الأداة.ملاحظة: استخدم الأمر “cd <>” للانتقال إلى أية مجلدات فرعية من التعليمات البرمجية. لتشغيل أي ملف python ، استخدم الأمر “python <>.py”. يحتوي العرض التقديمي المسمى “البرنامج التعليمي.pptx” على مجموعة كاملة من الإرشادات لاستخدام نموذج التجزئة. قم بعمل نسخة أو استخدم المجلد “2. محاكاة الميتوكوندريا Airy” ، وإعادة تسميتها (يتم استخدام Airy هنا لأنها وظيفة PSF الأقرب إلى المجهر متحد البؤر ، والذي تم استخدامه كمجهر حالي). انتقل إلى المجلد المسمى “محاكاة”.ملاحظة: يحتوي هذا المجلد على كافة الملفات المتعلقة بمحاكاة بيانات التدريب. هناك ثلاث مجموعات من المعلمات التي سيتم تعيينها للمحاكاة. أولا ، بالنسبة للمحاكي في ملف التكوين الدفعي “simulator / batch / bxx.csv” ، قم بتعيين المعلمات لحوالي العينة ، بما في ذلك عدد الميتوكوندريا ، ونطاق الأقطار وأطوال الهياكل ، ونطاق المحور z الذي يعرضه الهيكل ، وكثافة الفلوروفور. بعد ذلك ، قم بتعيين المعلمات المتعلقة بالنظام البصري.تتضمن هذه المجموعة نوع المجهر (الذي يحدد نموذج PSF المحدد) ، والفتحة العددية (N.A.) ، والتكبير (M) ، وحجم البكسل (بالميكرومتر) ، والطول الموجي للانبعاث للفلوروفورات ، ومعلمة ضوضاء الخلفية ، إلخ. اضبط المعلمات البصرية ل NA والتكبير والحد الأدنى للطول الموجي لمجموعة البيانات في الملف “simulator / microscPSFmod.py”. اضبط القيمة المطلوبة لحجم البكسل ، واضبط الطول الموجي للانبعاث لمجموعة البيانات كمعلمة للوظيفة “process_matrix_all_z” في الملف “simulator / generate_batch_parallel.py”. قم بتعيين المعلمات الثلاثة الأخيرة للوظيفة “save_physics_gt” في الملف “simulator / generate_batch_parallel.py”. المعلمات هي حجم البكسل (بالنانومتر) وحجم صورة الإخراج max_xy. قم بتعيين المجموعة الثالثة من المعلمات المتعلقة بمجموعة بيانات الإخراج ، مثل حجم الصور الناتجة ، وعدد المربعات في كل صورة ، وعدد الصور الإجمالية ، في الملف “simulator / generate_batch_parallel.py”. قم بتشغيل الملف “محاكي / generate_batch_parallel.py” لبدء المحاكاة. للحصول على صورة بالحجم النهائي، قم بعمل نسخة من المجلد المسمى “5. إعداد البيانات والتدريب / إعداد البيانات” في المجلد الرئيسي ، وانتقل إليه.ملاحظة: يتم تشكيل كل صورة من مجموعة البيانات الاصطناعية عن طريق إنشاء مونتاج لأربع صور محاكاة من 128 بكسل × 128 بكسل ، مما يعطي حجم صورة نهائي يبلغ 256 بكسل × 256 بكسل. يولد هذا أولا العديد من المربعات الفردية (حوالي 12000) لكل من صور المجهر (في مجلد “الإخراج”) وتجزئة الحقيقة الأرضية (في مجلد “الإخراج / physics_gt”).قم بتعيين معلمات رقم الدفعة وعدد الصور لكل دفعة ونطاق الضوضاء في “data_generator.py”. قم بتشغيل الملف “data_generator.py” لإنشاء صور المونتاج. انسخ المجلدات المسماة “صورة” و “جزء” إلى “5. إعداد البيانات والتدريب / datatrain / train” مجلد من المجلد “5. إعداد البيانات والتدريب / إعداد البيانات / البيانات “. 6. التجزئة القائمة على التعلم العميق تدريب نموذج التجزئة على الصور المحاكاة على النحو التالي:لتدريب نموذج التجزئة لمجهر جديد ، انتقل إلى “5. إعداد البيانات والتدريب / التدريب” ، وتعيين معلمات حجم الدفعة ، ونموذج العمود الفقري للتجزئة ، وعدد العصور ، ومعدل التعلم للتدريب في الملف “train_UNet.py”. قم بتشغيل “train_UNet.py” لبدء التدريب. تعرض عملية التدريب مقياس أداء التجزئة على مجموعة التحقق من الصحة المحاكاة.ملاحظة: بعد اكتمال التدريب، يتم حفظ النموذج ك “best_model.h5” في “5. مجلد إعداد البيانات والتدريب / التدريب”. اختبر النموذج على صور مجهر حقيقية مقسمة إلى حجم مرغوب فيه للنموذج المدرب من خلال الخطوات التالية.انتقل إلى “6. إعداد بيانات الاختبار”، وانسخ “. PNG” تنسيق ملفات البيانات في المجلد “PNG”. قم بتشغيل الملف “split_1024_256.py” لتقسيم الصور إلى حجم مرغوب فيه للنموذج المدرب. يؤدي هذا إلى إنشاء محاصيل بحجم 256 بكسل × 256 بكسل للصور في مجلد “البيانات”. انسخ مجلد “البيانات” الذي تم إنشاؤه إلى “7. اختبار التجزئة” المجلد. انتقل إلى المجلد “7. اختبار التجزئة” ، وقم بتعيين اسم النموذج المحفوظ المراد استخدامه. لتقسيم المحاصيل ، قم بتشغيل الملف “segment.py”. يتم حفظ الصور المجزأة في مجلد “الإخراج”. 7. التحليل المورفولوجي: تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا لمجموعتي البيانات ، “الجلوكوز” و “CCCP” رتب البيانات المراد تحليلها (مجلد واحد لكل صورة ، مع احتواء كل مجلد على اقتصاصات الإخراج المجزأة لصورة واحدة). قم بتنزيل الملف التكميلي المسمى “make_montage.py” ووضعه في المجلد المسمى “7. اختبار التجزئة”. قم بتشغيل الملف “make_montage.py” لربط الإخراج المجزأ مرة أخرى إلى الحجم الأصلي للصورة. إنشاء مجلد جديد باسم “9. التحليل المورفولوجي” داخل مجلد “src”. قم بتثبيت حزم Skan16 و Seaborn Python في البيئة باستخدام الأمر “pip install seaborn [stats] skan”.ملاحظة: أقنعة التجزئة هيكلية باستخدام المكتبة المسماة Skan لتمكين تحليل طوبولوجيا كل ميتوكوندريون فردي. ضع الملف التكميلي ” analyze_mitochondria.py ” في المجلد “9. التحليل المورفولوجي”. رتب صور مجموعات مختلفة من التجربة في مجلدات مختلفة داخل المجلد “7. اختبار التجزئة”. اضبط معلمات “حجم البكسل” و “مسار الإدخال” في الملف “analyze_mitochondria.py”. قم بتشغيل الملف ” analyze_mitochondria.py” لتشغيل الكود للهيكل العظمي وإنشاء مؤامرات للتحليل.

Representative Results

تظهر نتائج أجزاء التعلم العميق للميتوكوندريا في الصور متحدة البؤر للخلايا العضلية القلبية الثابتة التي تعبر عن علامات الميتوكوندريا الفلورية فائدة هذه الطريقة. هذه الطريقة متوافقة مع أنواع الخلايا وأنظمة الفحص المجهري الأخرى ، والتي تتطلب إعادة التدريب فقط. تم علاج الأرومات العضلية القلبية H9c2 المتكيفة مع الجالاكتوز مع الميتوكوندريا الفلورية مع أو بدون CCCP لمدة 2 ساعة. ثم تم إصلاح الخلايا ، وصبغها بصبغة نووية ، وتركيبها على شرائح زجاجية لتحليل الفحص المجهري الفلوري. تم استخدام مجهر متحد البؤر للحصول على صور لكل من الخلايا الضابطة والخلايا المعالجة ب CCCP. أجرينا تحليلنا على 12 صورة متحدة البؤر ، مع ما يقرب من 60 خلية لكل حالة. ثم تم تحديد الحالة المورفولوجية للميتوكوندريا في كل صورة وقياسها. تم تصميم أقنعة التجزئة التي تم الحصول عليها من النموذج المدرب لتمكين تحليل طوبولوجيا كل ميتوكوندريون فردي لهذه التجربة. تم استخدام طول فرع الميتوكوندريا الفردية كمعلمة للتصنيف. تم تصنيف الميتوكوندريا الفردية إلى فئات مورفولوجية حسب القاعدة التالية. على وجه التحديد ، تم اعتبار أي هيكل عظمي للميتوكوندريا بطول أقل من 1,500 نانومتر نقطة ، وتم تصنيف الميتوكوندريا الأطول إلى شبكة أو قضيب. إذا كان هناك تقاطع واحد على الأقل حيث يتقاطع فرعان أو أكثر ، يتم تعريفه على أنه شبكة ؛ خلاف ذلك ، تم تصنيف الميتوكوندريا على أنها قضيب. يوضح الشكل 3 مثالا على صورة الهياكل العظمية للميتوكوندريا المشار إليها بفئات المورفولوجيا. يوضح تصنيف مورفولوجيا الميتوكوندريا في الشكل 4A أنه من الممكن اكتشاف تغييرات كبيرة عند تطبيق CCCP لمدة 2 ساعة ؛ يتضح هذا بشكل أوضح من خلال الزيادة في النقاط للخلايا المعالجة ب CCCP. متوسط طول الفرع في الشكل 4B هو وسيلة أخرى لتوضيح التغيرات المهمة التي يمكن اكتشافها في المورفولوجيا. كما هو متوقع ، تم تقليل كل من القضبان والشبكات بشكل كبير بالنسبة للتحكم عندما تم التعامل مع الخلايا باستخدام CCCP. كانت الزيادة الكبيرة في متوسط أطوال فروع النقاط متوقعة أيضا نظرا للتورم الذي تتعرض له الميتوكوندريا عند تعرضها ل CCCP. الشكل 1: خط أنابيب لمحاكاة صور الفحص المجهري الفلوري. يتضمن خط الأنابيب (i) توليد هندسة 3D ، (ii) بواعث ومضاهاة الحركية الضوئية ، (iii) التفاف 3D PSF ، (iv) إضافة الضوضاء ، و (v) binarization. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 2: خطوات التحليل القائم على التعلم الآلي لمورفولوجيا الميتوكوندريا . (1) يتم اقتصاص الصور المراد تجزئتها أولا إلى أحجام مقبولة لنموذج التجزئة. (2) يتم تطبيق التجزئة القائمة على التعلم العميق على محاصيل الصور. (3) يتم خياطة محاصيل الإنتاج المجزأة إلى حجمها الأصلي. (4) الأجزاء المركبة هيكلية. (6) يتم إجراء التحليل المورفولوجي بناء على الطوبولوجيا من الهياكل العظمية. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 3: هيكل عظمي للميتوكوندريا متراكب على ناتج تجزئة صور الفحص المجهري . (أ) ناتج التجزئة. (ب) الهيكل العظمي المستقيم (المسافة الإقليدية بين نقطتي البداية والنهاية للفرع) متراكب أعلى ناتج التجزئة. يصور الترميز اللوني للهيكل العظمي فئة الميتوكوندريا. الشبكات حمراء ، والقضبان خضراء ، والنقاط أرجوانية اللون. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 4: تحليل مورفولوجيا الميتوكوندريا. (أ) نظرة عامة على النسبة المئوية النسبية للفئات المورفولوجية المختلفة بناء على الطول الكلي للميتوكوندريا. (ب) مقارنة متوسط طول فرع الميتوكوندريا بين الظروف التجريبية وبين الفئات المورفولوجية. يعرض المحور السيني التصنيفات المورفولوجية ، ويعرض المحور ص متوسط طول فرع الميتوكوندريا بالنانومتر (نانومتر). تظهر الدلالة الإحصائية في شكل قيم p على النحو التالي * p < 0.05 و ** p < 0.01 و *** p < 0.001 و **** p < 0.0001. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل. الشكل 5: حالة فشل التجزئة. تعد الكثافة العالية للميتوكوندريا سيناريو صعبا لنموذج التجزئة. يظهر الهيكل العظمي الملون أطول ميتوكوندريا مفردة تم اكتشافها في الصورة. من خلال إجراء قياسات الطول ، يمكن اكتشاف هذه السيناريوهات والعمل عليها لتحسين نتائج التجزئة باستخدام تآكل المشغل المورفولوجي (يقلل الهيكل العظمي المكتشف). الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

Discussion

نناقش الاحتياطات المتعلقة بالخطوات الحرجة في البروتوكول في الفقرات المتعلقة ب “توليد الهندسة” و “معلمات المحاكاة”. تناقش الفقرة التي تحمل عنوان “نقل التعلم” التعديلات على الإنتاجية الأعلى عند التكيف مع المجاهر المتعددة. تشير الفقرات المتعلقة ب “تحليل الجسيمات” و “توليد هياكل تحت خلوية أخرى” إلى التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة. تناقش الفقرة المتعلقة ب “الاختلاف عن الحقيقة البيولوجية” الأسباب المختلفة التي تجعل عمليات المحاكاة تختلف عن البيانات الحقيقية وما إذا كانت هذه الأسباب تؤثر على تطبيقنا. أخيرا ، نناقش سيناريو صعبا لطريقتنا في فقرة “الهياكل المعبأة بكثافة”.

توليد الهندسة
لتوليد هندسة 3D من الميتوكوندريا، بنية 2D بسيطة تم إنشاؤها من منحنيات b-spline كهياكل عظمية يعمل بشكل جيد لإنشاء مجموعة البيانات الاصطناعية. هذه الأشكال الاصطناعية تحاكي عن كثب أشكال الميتوكوندريا التي لوحظت في ثقافات الخلايا 2D. ومع ذلك ، في حالة الأنسجة 3D مثل أنسجة القلب ، فإن شكل وترتيب الميتوكوندريا مختلفان تماما. في مثل هذه الحالات ، قد يتحسن أداء نموذج التجزئة مع إضافة الاتجاه في الصور المحاكاة.

معلمات المحاكاة
يجب توخي الحذر عند تعيين معلمات المحاكي للتأكد من مطابقتها لتلك الخاصة بالبيانات لتشغيل الاستدلال عليها ، لأن الفشل في القيام بذلك يمكن أن يؤدي إلى انخفاض الأداء في التجزئة. أحد هذه المعلمات هو نطاق نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR). يجب أن يتطابق نطاق SNR للبيانات المراد اختبارها مع قيم مجموعة البيانات المحاكاة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب أن يتطابق PSF المستخدم مع بيانات الاختبار المستهدفة. على سبيل المثال ، لا ينبغي استخدام الصور المدربة على النموذج من PSF متحد البؤر لاختبار الصور من مجهر فوق الفلورسنت. معلمة أخرى يجب الانتباه إليها هي استخدام التكبير الإضافي في بيانات الاختبار. إذا تم استخدام تكبير إضافي في بيانات الاختبار ، فيجب أيضا تعيين المحاكي بشكل مناسب.

نقل التعلم
نقل التعلم هو ظاهرة الاستفادة من نموذج مستفاد تم تدريبه على مهمة واحدة لاستخدامه في مهمة أخرى. تنطبق هذه الظاهرة أيضا على مشكلتنا فيما يتعلق بأنواع مختلفة من بيانات المجهر. يمكن استخدام أوزان نموذج التجزئة (المزود بشفرة المصدر) الذي تم تدريبه على نوع واحد من بيانات الفحص المجهري لتهيئة نموذج تجزئة لاستخدامه في نوع آخر من بيانات المجهر الضوئي. يتيح لنا ذلك التدريب على مجموعة فرعية أصغر بكثير من مجموعة بيانات التدريب (3000 صورة مقارنة ب 10000) ، وبالتالي تقليل التكاليف الحسابية للمحاكاة.

تحليل الجسيمات
يمكن أيضا إجراء تحليل الجسيمات على الأقنعة المجزأة. يمكن أن يوفر هذا معلومات عن مساحة الميتوكوندريا الفردية وانحناءها ، وما إلى ذلك. يمكن أن تكون هذه المعلومات أيضا بمثابة مقاييس للمقارنة الكمية للميتوكوندريا (لا تستخدم لهذه التجربة). على سبيل المثال ، في الوقت الحاضر ، نحدد مورفولوجيا النقطة باستخدام عتبة تعتمد على طول الميتوكوندريا. قد يكون من المفيد ، في بعض الحالات ، دمج الإهليلجية لفصل الميتوكوندريا الصغيرة الشبيهة بالقضيب بشكل أفضل عن النقاط النقطية أو الميتوكوندريا الشبيهة بالنقاط. بدلا من ذلك ، إذا تسببت بعض الظروف البيولوجية في تجعد الميتوكوندريا ، فقد يكون القياس الكمي للانحناء ذا أهمية لتحليل سكان الميتوكوندريا.

توليد هياكل فرعية أخرى
تم إثبات التجزئة القائمة على الفيزياء للهياكل تحت الخلوية للميتوكوندريا والحويصلات1. على الرغم من أن الحويصلات تظهر أشكالا مختلفة ، إلا أن أحجامها أصغر ، وتظهر ككرات بسيطة عند ملاحظتها من خلال مجهر مضان. وبالتالي ، يتم محاكاة هندسة الحويصلات باستخدام هياكل كروية ذات نطاق قطر مناسب. هذا يعني أن التغيير في الوظيفة يولد الهندسة (الأسطوانات في حالة الميتوكوندريا والمجالات في حالة الحويصلات) للهياكل والمعلمات ذات الصلة (الخطوة 5.4 في قسم البروتوكول). هندسيا ، تم أيضا محاكاة الشبكة الإندوبلازمية والأنابيب الدقيقة كهياكل أنبوبية17. توفر نمذجة الشبكة الإندوبلازمية بقطر 150 نانومتر والأنابيب الدقيقة التي يبلغ متوسط قطرها الخارجي 25 نانومتر وأنبوب مجوف داخلي يبلغ قطره 15 نانومتر تقديرات تقريبية لأشكال هذه الهياكل. معلمة أخرى ستختلف لكل من هذه الهياكل الخلوية الفرعية هي كثافة الفلوروفور. يتم حساب ذلك بناء على توزيع الجزيء الحيوي الذي ترتبط به الفلوروفورات واحتمال الارتباط.

الفرق من الحقيقة الأرضية البيولوجية
تختلف البيانات المحاكاة المستخدمة للتدريب تحت إشراف المحاكاة لنموذج التعلم العميق عن البيانات الحقيقية من نواح كثيرة. (ط) يختلف عدم وجود علامات غير محددة في البيانات المحاكاة عن البيانات الحقيقية، حيث توجد في كثير من الأحيان مركبات فلوروفورات حرة عائمة في البيانات الحقيقية. يؤدي هذا إلى ارتفاع متوسط قيمة الخلفية في الصورة الحقيقية. يتم تخفيف هذا الاختلاف عن طريق مطابقة SNR وتعيين قيمة الخلفية بحيث تتطابق مع القيم الحقيقية المرصودة. (ii) حركة الهياكل تحت الخلوية والحركية الضوئية هما مصدران للديناميكيات في النظام. تتسبب الهياكل المتحركة في الخلايا الحية (التي تتحرك في نطاق بضعة أجزاء من الثانية) في ضبابية الحركة. يتم تقليل وقت التعرض أثناء الحصول على البيانات الحقيقية لتجنب تأثير التعتيم. من ناحية أخرى ، نحن لا نحاكي الفاصل الزمني ونفترض هياكل بلا حراك. هذا الافتراض صحيح عندما يكون وقت التعرض في البيانات الحقيقية صغيرا. ومع ذلك ، قد ينتج عن هذا الافتراض خطأ في الإخراج إذا كان وقت التعرض للبيانات الحقيقية كبيرا بما يكفي لإدخال ضبابية الحركة. من ناحية أخرى ، فإن الحركية الضوئية في حدود النانو ثانية إلى ميكروثانية ويمكن حذفها في المحاكاة ، نظرا لأن أوقات التعرض المعتادة للتجارب طويلة بما يكفي (بترتيب أجزاء من الثانية) لمتوسط تأثيرات الحركية الضوئية. (iii) الضوضاء في صور المجهر لها مصادر مختلفة ، وهذه المصادر لها وظائف كثافة احتمالية مختلفة. بدلا من نمذجة هذه المصادر الفردية للضوضاء ، نقترب منها على أنها ضوضاء غاوسية على خلفية ثابتة. لا يغير هذا الاختلاف بشكل كبير توزيع البيانات لظروف نسبة الإشارة إلى الخلفية المنخفضة (في حدود 2-4) وعند التعامل مع الكثافة الكلية للفلوروفورات1. (iv) يمكن أن تنشأ القطع الأثرية في التصوير من الانحرافات والانجراف والتمويه المنهجي. نفترض أن المجهر محاذ جيدا وأن المناطق المختارة للتحليل في البيانات الحقيقية خالية من هذه القطع الأثرية. هناك أيضا إمكانية نمذجة بعض هذه القطع الأثرية في PSF18،19،20.

هياكل مكتظة بكثافة
الصعوبات في عدم القدرة على التمييز بين قضبان متداخلة من الشبكات هي مشكلة مستمرة في تجزئة بيانات الفحص المجهري 2D. يتم تقديم سيناريو صعب للغاية في الشكل 5 ، حيث تكون الميتوكوندريا معبأة بكثافة ، مما يؤدي إلى نتائج دون المستوى الأمثل في نموذج التجزئة والتحليل التالي. على الرغم من هذا التحدي ، فإن استخدام العوامل المورفولوجية في مثل هذه المواقف لتنحيف الهيكل العظمي يمكن أن يساعد في كسر هذه الشبكات المتصلة بشكل مفرط مع السماح باكتشاف تغييرات كبيرة في جميع فئات مورفولوجيا الميتوكوندريا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن استخدام مجهر متحد البؤر بدلا من مجهر واسع المجال للتصوير هو إحدى الطرق للتخفيف جزئيا من هذه المشكلة عن طريق القضاء على الضوء خارج نطاق التركيز. علاوة على ذلك ، في المستقبل ، سيكون من المفيد إجراء تجزئة 3D للتمييز بين الميتوكوندريا التي تتقاطع (أي تشكل شبكة فعليا) من الميتوكوندريا الشبيهة بالقضيب التي تتداخل إسقاطاتها في مستوى واحد مع بعضها البعض.

يعد تجزئة التعلم العميق أداة واعدة توفر توسيع قدرات التحليل لمستخدمي الفحص المجهري ، وبالتالي فتح إمكانية التحليل الآلي للبيانات المعقدة ومجموعات البيانات الكمية الكبيرة ، والتي كانت في السابق غير قابلة للإدارة.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

يعترف المؤلفون بالمناقشة مع عارف أحمد سخ. تم الاعتراف بزامبارلال بوجابال للمساعدة في بناء خلايا H9c2 المستقرة. نحن نعترف بالتمويل التالي: منحة بدء ERC رقم 804233 (إلى KA) ، منحة مشروع الباحث للتجديد العلمي رقم 325741 (إلى D.K.P.) ، منحة هيئة الصحة الإقليمية لشمال النرويج رقم. HNF1449-19 (Å.B.B.) ، ومشروع التمويل المواضيعي ل UiT VirtualStain مع معرف مشروع كريستين 2061348 (D.K.P. ، Å.B.B. ، K.A. ، و A.H.).

Materials

12-well plate FALCON 353043
Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25% Electron Microscopy Sciences 16200
Axio Vert.A1 Zeiss Brightfield microscope
CCCP Sigma-Aldrich C2759
Computer n/a n/a Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory
Coverslips VWR 631-0150
DAPI (stain) Sigma-Aldrich D9542
DMEM gibco 11966-025
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F7524
Glass Slides (frosted edge) epredia AA00000112E01MNZ10
H9c2 mCherry-EGFP-OMP25 In-house stable cell line derived from purchased cell line
Incubator Thermo Fisher Scientific 51033557
LSM 800 Zeiss Confocal Microscope
Mounting Media (Glass) Thermo Fisher Scientific P36980
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS Thermo Fisher Scientific J19943-K2
Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4 Zeiss 420782-9900-000
Sterile laminar flow hood Labogene SCANLAF MARS
Trypsin Sigma-Aldrich T4049
Vacusafe aspiration system VACUUBRAND 20727400
ZEN 2.6 Zeiss

References

  1. Sekh, A. A., et al. Physics-based machine learning for subcellular segmentation in living cells. Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).
  2. Pernas, L., Scorrano, L. Mito-morphosis: Mitochondrial fusion, fission, and cristae remodeling as key mediators of cellular function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
  3. Li, Y., et al. Imaging of macrophage mitochondria dynamics in vivo reveals cellular activation phenotype for diagnosis. Theranostics. 10 (7), 2897-2917 (2020).
  4. Xu, X., Xu, S., Jin, L., Song, E. Characteristic analysis of Otsu threshold and its applications. Pattern Recognition Letters. 32 (7), 956-961 (2011).
  5. MorphoLibJ: MorphoLibJ v1.2.0. Zenodo Available from: https://zenodo.org/record/50694#.Y8qfo3bP23A (2016)
  6. Trainable_Segmentation: Release v3.1.2. Zenodo Available from: https://zenodo.org/record/59290#.Y8qf13bP23A (2016)
  7. Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 289 (2022).
  8. Xue, F., Li, J., Blu, T. Fast and accurate three-dimensional point spread function computation for fluorescence microscopy. Journal of the Optical Society of America A. 34 (6), 1029-1034 (2017).
  9. Lanni, F., Gibson, S. F. Diffraction by a circular aperture as a model for three-dimensional optical microscopy. Journal of the Optical Society of America A. 6 (9), 1357-1367 (1989).
  10. Sekh, A. A., et al. Physics based machine learning for sub-cellular segmentation in living cells. Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).
  11. Liu, Y., Song, X. D., Liu, W., Zhang, T. Y., Zuo, J. Glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in PC12 cell line. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 7 (1), 49-56 (2003).
  12. Dott, W., Mistry, P., Wright, J., Cain, K., Herbert, K. E. Modulation of mitochondrial bioenergetics in a skeletal muscle cell line model of mitochondrial toxicity. Redox Biology. 2, 224-233 (2014).
  13. Ishihara, N., Jofuku, A., Eura, Y., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology by membrane potential, and DRP1-dependent division and FZO1-dependent fusion reaction in mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (4), 891-898 (2003).
  14. Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8, 350 (2018).
  15. Ganote, C. E., Armstrong, S. C. Effects of CCCP-induced mitochondrial uncoupling and cyclosporin A on cell volume, cell injury and preconditioning protection of isolated rabbit cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (7), 749-759 (2003).
  16. Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 2018, 4312 (2018).
  17. Sage, D., et al. Super-resolution fight club: Assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16, 387-395 (2019).
  18. Yin, Z., Kanade, T., Chen, M. Understanding the phase contrast optics to restore artifact-free microscopy images for segmentation. Medical Image Analysis. 16 (5), 1047-1062 (2012).
  19. Malm, P., Brun, A., Bengtsson, E. Simulation of bright-field microscopy images depicting pap-smear specimen. Cytometry. Part A. 87 (3), 212-226 (2015).
  20. Bifano, T., Ünlü, S., Lu, Y., Goldberg, B. Aberration compensation in aplanatic solid immersion lens microscopy. Optical Express. 21 (23), 28189-28197 (2013).

Play Video

Cite This Article
Punnakkal, A. R., Godtliebsen, G., Somani, A., Andres Acuna Maldonado, S., Birna Birgisdottir, Å., Prasad, D. K., Horsch, A., Agarwal, K. Analyzing Mitochondrial Morphology Through Simulation Supervised Learning. J. Vis. Exp. (193), e64880, doi:10.3791/64880 (2023).

View Video