फेफड़े-व्युत्पन्न नमूनों से माइक्रोवस्कुलर और मैक्रोवास्कुलर एंडोथेलियल सेल अलगाव और शुद्धिकरण
Summary
हालांकि चुनौतीपूर्ण, फुफ्फुसीय एंडोथेलियल कोशिकाओं का अलगाव फेफड़ों की सूजन पर अध्ययन के लिए आवश्यक है। वर्तमान प्रोटोकॉल मैक्रोवास्कुलर और माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं के उच्च उपज, उच्च शुद्धता अलगाव के लिए एक प्रक्रिया का वर्णन करता है।
Abstract
स्वस्थ और रोगग्रस्त ऊतकों और अंगों से पृथक कोशिकाओं की उपलब्धता व्यक्तिगत चिकित्सा दृष्टिकोण के लिए एक महत्वपूर्ण तत्व का प्रतिनिधित्व करती है। यद्यपि बायोबैंक बायोमेडिकल अनुसंधान के लिए प्राथमिक और अमर कोशिकाओं का एक विस्तृत संग्रह प्रदान कर सकते हैं, ये सभी प्रयोगात्मक आवश्यकताओं को कवर नहीं करते हैं, विशेष रूप से विशिष्ट बीमारियों या जीनोटाइप से संबंधित। संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) प्रतिरक्षा भड़काऊ प्रतिक्रिया के प्रमुख घटक हैं और इस प्रकार, विभिन्न प्रकार के विकारों के रोगजनन में एक केंद्रीय भूमिका निभाते हैं। विशेष रूप से, विभिन्न साइटों के ईसीएस विभिन्न जैव रासायनिक और कार्यात्मक गुणों को प्रदर्शित करते हैं, जिससे विश्वसनीय प्रयोगों को डिजाइन करने के लिए विशिष्ट ईसी प्रकारों (यानी, मैक्रोवास्कुलर, माइक्रोवास्कुलर, धमनी और शिरापरक) की उपलब्धता आवश्यक हो जाती है। यहां, फुफ्फुसीय धमनी और फेफड़ों के पैरेन्काइमा से उच्च उपज, लगभग शुद्ध मानव मैक्रोवास्कुलर और माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए सरल प्रक्रियाओं को विस्तार से चित्रित किया गया है। वाणिज्यिक स्रोतों से स्वतंत्रता प्राप्त करने और ईसी फेनोटाइप/ जीनोटाइप प्राप्त करने के लिए किसी भी प्रयोगशाला द्वारा अपेक्षाकृत कम लागत पर इस पद्धति को आसानी से पुन: पेश किया जा सकता है जो अभी तक उपलब्ध नहीं हैं।
Introduction
संवहनी एंडोथेलियम रक्त वाहिकाओं की आंतरिक सतह को रेखाबद्ध करता है। यह रक्त जमावट, संवहनी टोन और प्रतिरक्षा-भड़काऊ प्रतिक्रियाओंको विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है1,2,3,4. यद्यपि मानव नमूनों से अलग एंडोथेलियल कोशिकाओं (ईसी) की संस्कृति अनुसंधान उद्देश्यों के लिए आवश्यक है, यह टिप्पणी की जानी चाहिए कि विभिन्न रक्त वाहिकाओं (धमनियों, नसों, केशिकाओं) से ईसी के विशिष्ट कार्य हैं। इन्हें मानव नाभि शिरा एंडोथेलियल कोशिकाओं (एचयूवीईसी) द्वारा पूरी तरह से पुन: प्राप्त नहीं किया जा सकता है, जो संवहनी एंडोथेलियम पैथोफिज़ियोलॉजी 5,6 पर अध्ययन में आसानी से उपलब्ध और व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं। उदाहरण के लिए, मानव फेफड़े के माइक्रोवस्कुलर एंडोथेलियल कोशिकाएं (एचएलएमवीईसी) ल्यूकोसाइट भर्ती और संचय 4,7 को नियंत्रित करके फेफड़ों की सूजन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। इस प्रकार, उच्च निष्ठा के साथ फेफड़ों की सूजन को पुन: उत्पन्न करने के उद्देश्य से एक प्रयोगात्मक सेटिंग में एचएलएमवीईसी शामिल होना चाहिए। दूसरी ओर, ईसी शिथिलता को कई विकृतियों में देखा जा सकता है; इसलिए, रोगी से ईसी रोग के एक विश्वसनीय इन विट्रो मॉडल के निर्माण के लिए मौलिक हैं। उदाहरण के लिए, फुफ्फुसीय धमनी (एचपीएईसी) से ईसी के टुकड़ों के अलगाव, सिस्टिक फाइब्रोसिस (सीएफ) से प्रभावित लोगों के खोजे गए फेफड़ों से विच्छेदित, ने हमेंइस बीमारी में एंडोथेलियल डिसफंक्शन के तंत्र को उजागर करने में सक्षम बनाया है।
इस प्रकार, रोग राज्यों में भी विभिन्न स्रोतों / अंगों से ईसी के अलगाव को अनुकूलित करने के उद्देश्य से प्रोटोकॉल जांचकर्ताओं को मूल्यवान अनुसंधान उपकरण प्रदान करने के लिए आवश्यक हैं, खासकर जब ये उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। एचएलएमवीईसी और एचपीएईसी आइसोलेशन प्रोटोकॉल को पहले 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 बताया गया है। सभी मामलों में, फेफड़ों के नमूनों के एंजाइमेटिक पाचन के परिणामस्वरूप मिश्रित कोशिका आबादी हुई, जिन्हें तदर्थ चयनात्मक मीडिया और चुंबकीय मोती- या साइटोमेट्रिक-आधारित सेल सॉर्टिंग का उपयोग करके शुद्ध किया गया था। इन प्रोटोकॉल के आगे के अनुकूलन को ईसी अलगाव में दो मुख्य मुद्दों को संबोधित करना चाहिए: (1) सेल और ऊतक संदूषण, जिसे ईसी प्रतिकृति शिथिलताको कम करने के लिए जल्द से जल्द संभव संस्कृति मार्ग पर हल किया जाना चाहिए; और (2) प्राथमिक ईसी आइसोलेट्स की कम उपज।
यह अध्ययन एचएलएमवीईसी और एचपीएईसी के उच्च उपज, उच्च शुद्धता अलगाव के लिए एक नए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। यह प्रक्रिया आसानी से लागू हो सकती है और कुछ चरणों में लगभग शुद्ध मैक्रोवास्कुलर और माइक्रोवैस्कुलर ईसी दे सकती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मानव पैथोफिज़ियोलॉजी में संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं द्वारा निभाई गई कई भूमिकाएं इन कोशिकाओं को इन विट्रो पैथोजेनेटिक और फार्माकोलॉजिकल अध्ययनों के लिए एक अनिवार्य उपकरण बनाती हैं। चूंकि विभिन…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को विश्वविद्यालय और अनुसंधान के इतालवी मंत्रालय (पूर्व 60% 2021 और 2022) से आरपी और इतालवी सिस्टिक फाइब्रोसिस फाउंडेशन (एफएफसी # 23/2014) और इतालवी स्वास्थ्य मंत्रालय (एल 548/93) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
