Mikrovaskulær og makrovaskulær endotelcelleisolasjon og rensing fra lungeavledede prøver
Summary
Selv om det er utfordrende, er isolering av pulmonale endotelceller avgjørende for studier på lungebetennelse. Denne protokollen beskriver en prosedyre for høyavkastningsisolering av makrovaskulære og mikrovaskulære endotelceller med høy renhet.
Abstract
Tilgjengeligheten av celler isolert fra friske og syke vev og organer representerer et nøkkelelement for personlig medisin tilnærminger. Selv om biobanker kan gi en bred samling av primære og immortaliserte celler for biomedisinsk forskning, dekker disse ikke alle eksperimentelle behov, spesielt de som er relatert til spesifikke sykdommer eller genotyper. Vaskulære endotelceller (EC) er nøkkelkomponenter i den immuninflammatoriske reaksjonen og spiller dermed en sentral rolle i patogenesen av en rekke lidelser. Spesielt viser ECs fra forskjellige steder forskjellige biokjemiske og funksjonelle egenskaper, noe som gjør tilgjengeligheten av spesifikke EC-typer (dvs. makrovaskulær, mikrovaskulær, arteriell og venøs) avgjørende for å designe pålitelige eksperimenter. Her illustreres enkle prosedyrer for å oppnå høyutbytte, tilnærmet rene humane makrovaskulære og mikrovaskulære endotelceller fra lungearterien og lungeparenkymet i detalj. Denne metoden kan enkelt reproduseres til en relativt lav kostnad av ethvert laboratorium for å oppnå uavhengighet fra kommersielle kilder og oppnå EF-fenotyper / genotyper som ennå ikke er tilgjengelige.
Introduction
Det vaskulære endotelet strekker den indre overflaten av blodkarene. Det spiller nøkkelroller i regulering av blodkoagulasjon, vaskulær tone og immuninflammatoriske responser 1,2,3,4. Selv om kulturen av endotelceller (EC) isolert fra humane prøver er avgjørende for forskningsformål, må det bemerkes at EC fra forskjellige blodkar (arterier, vener, kapillærer) har spesifikke funksjoner. Disse kan ikke rekapituleres fullt ut av humane endotelceller i navlestrengen (HUVEC), som er lett tilgjengelige og mye brukt i studier på patofysiologi ved vaskulær endotel 5,6. For eksempel spiller humane lungemikrovaskulære endotelceller (HLMVEC) nøkkelroller i lungebetennelse ved å kontrollere leukocytrekruttering og akkumulering 4,7. Dermed bør en eksperimentell setting rettet mot å reprodusere lungebetennelse med høy troskap inkludere HLMVEC. På den annen side kan EC dysfunksjon observeres i flere patologier; Derfor er ECs fra pasienten grunnleggende for å bygge en pålitelig in vitro-modell av sykdommen. For eksempel har isoleringen av fragmenter av EC fra lungearterien (HPAEC), dissekert fra de eksplanterte lungene til mennesker som er rammet av cystisk fibrose (CF), gjort det mulig for oss å avdekke mekanismer for endoteldysfunksjon i denne sykdommen 8,9.
Derfor er protokoller som tar sikte på å optimalisere isoleringen av EC fra forskjellige kilder / organer også i sykdomstilstander, avgjørende for å gi etterforskere verdifulle forskningsverktøy, spesielt når disse verktøyene ikke er kommersielt tilgjengelige. HLMVEC og HPAEC isolasjonsprotokoller er tidligere rapportert 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. I alle tilfeller resulterte den enzymatiske fordøyelsen av lungeprøvene i blandede cellepopulasjoner, som ble renset ved hjelp av ad hoc selektive medier og magnetiske perler- eller cytometrisk-basert cellesortering. Ytterligere optimaliseringer av disse protokollene må ta opp to hovedproblemer i EF-isolasjon: (1) celle- og vevsforurensning, som bør løses så tidlig som mulig kulturpassasjer for å minimere EC-replikativ senescens20; og (2) det lave utbyttet av primære EC-isolater.
Denne studien beskriver en ny protokoll for isolering av høy avkastning og høy renhet av HLMVEC og HPAEC. Denne prosedyren kan lett anvendes og gi praktisk talt rene makrovaskulære og mikrovaskulære ECs i noen få trinn.
Protocol
Representative Results
Discussion
De mange rollene som vaskulære endotelceller spiller i human patofysiologi, gjør disse cellene til et uunnværlig verktøy for in vitro patogenetiske og farmakologiske studier. Siden ECs fra forskjellige vaskulære steder / organer viser spesielle egenskaper og funksjoner, vil tilgjengeligheten av sunne og syke ECs fra organet av interesse være ideell for forskningsformål. For eksempel er HLMVEC avgjørende for studier på lungebetennelse; Derfor vil en metodikk for høy avkastning, høy renhet isolasjon av …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av midler fra det italienske departementet for universitet og forskning (ex 60% 2021 og 2022) til RP og av tilskudd fra den italienske Cystic Fibrosis Foundation (FFC # 23/2014) og fra det italienske helsedepartementet (L548/93) til M. R.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
