Mikrovaskulär och makrovaskulär endotelcellsisolering och rening från lung-härledda prover
Summary
Även om det är utmanande är isoleringen av lungendotelceller avgörande för studier av lunginflammation. Detta protokoll beskriver ett förfarande för högavkastande isolering av makrovaskulära och mikrovaskulära endotelceller med hög renhet.
Abstract
Tillgången på celler isolerade från friska och sjuka vävnader och organ utgör ett nyckelelement för personliga medicinska metoder. Även om biobanker kan tillhandahålla en bred samling av primära och odödliga celler för biomedicinsk forskning, täcker dessa inte alla experimentella behov, särskilt de som är relaterade till specifika sjukdomar eller genotyper. Vaskulära endotelceller (EC) är nyckelkomponenter i immuninflammatorisk reaktion och spelar således en central roll i patogenesen av en mängd olika störningar. I synnerhet visar ECs från olika platser olika biokemiska och funktionella egenskaper, vilket gör tillgängligheten av specifika EC-typer (dvs. makrovaskulär, mikrovaskulär, arteriell och venös) avgörande för att utforma tillförlitliga experiment. Här illustreras enkla procedurer för att erhålla högavkastande, praktiskt taget rena humana makrovaskulära och mikrovaskulära endotelceller från lungartären och lungparenkymet i detalj. Denna metod kan lätt reproduceras till en relativt låg kostnad av vilket laboratorium som helst för att uppnå oberoende från kommersiella källor och erhålla EG-fenotyper/genotyper som ännu inte är tillgängliga.
Introduction
Det vaskulära endotelet leder blodkärlens inre yta. Det spelar nyckelroller för att reglera blodkoagulation, vaskulär ton och immuninflammatoriska svar 1,2,3,4. Även om odling av endotelceller (EC) isolerade från mänskliga prover är avgörande för forskningsändamål, måste det påpekas att ECs från olika blodkärl (artärer, vener, kapillärer) har specifika funktioner. Dessa kan inte helt rekapituleras av humana navelvenendotelceller (HUVEC), som är lättillgängliga och ofta används i studier av vaskulär endotelpatofysiologi 5,6. Till exempel spelar humana lungmikrovaskulära endotelceller (HLMVEC) nyckelroller vid lunginflammation genom att kontrollera leukocytrekrytering och ackumulering 4,7. Således bör en experimentell inställning som syftar till att reproducera lunginflammation med hög trohet inkludera HLMVEC. Å andra sidan kan EC-dysfunktion observeras i flera patologier; därför är ECs från patienten grundläggande för att bygga en tillförlitlig in vitro-modell av sjukdomen. Till exempel har isoleringen av fragment av ECs från lungartären (HPAECs), dissekerade från de explanterade lungorna hos personer som drabbats av cystisk fibros (CF), gjort det möjligt för oss att avslöja mekanismer för endoteldysfunktion i denna sjukdom 8,9.
Således är protokoll som syftar till att optimera isoleringen av ECs från olika källor / organ även i sjukdomstillstånd avgörande för att ge utredare värdefulla forskningsverktyg, särskilt när dessa verktyg inte är kommersiellt tillgängliga. HLMVEC- och HPAEC-isoleringsprotokoll har tidigare rapporterats 10,11,12,13,14,15,16,17,18,19. I samtliga fall resulterade den enzymatiska nedbrytningen av lungproverna i blandade cellpopulationer, som renades med hjälp av ad hoc-selektiva medier och magnetisk pärl- eller cytometrisk cellsortering. Ytterligare optimeringar av dessa protokoll måste ta itu med två huvudfrågor i EG-isolering: (1) cell- och vävnadskontaminering, som bör lösas så snart som möjligt odlingspassager för att minimera EG: s replikativa åldrande20; och (2) det låga utbytet av primära EG-isolat.
Denna studie beskriver ett nytt protokoll för isolering med hög avkastning och hög renhet av HLMVEC och HPAECs. Denna procedur kan lätt tillämpas och ge praktiskt taget rena makrovaskulära och mikrovaskulära ECs i några steg.
Protocol
Representative Results
Discussion
De många roller som vaskulära endotelceller spelar i human patofysiologi gör dessa celler till ett oumbärligt verktyg för in vitro patogenetiska och farmakologiska studier. Eftersom ECs från olika vaskulära platser / organ uppvisar speciella egenskaper och funktioner, skulle tillgängligheten av friska och sjuka ECs från det berörda organet vara idealisk för forskningsändamål. Till exempel är HLMVECs viktiga för studier av lunginflammation; Därför kommer en metod för isolering med hög avkastnin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av medel från det italienska ministeriet för universitet och forskning (ex 60% 2021 och 2022) till R. P. och genom bidrag från den italienska stiftelsen för cystisk fibros (FFC # 23/2014) och från det italienska hälsoministeriet (L548/93) till MR.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Used to detach cells from the culture plates |
| Anti CD31 Antibody, clone WM59 | Dako | M0823 | Used for CD-31 staining in immunocytochemistry. Dilution used: 1:50 |
| Anti vWF Antibody | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Used for von Willebrand factor staining in immunocytochemistry. Working dilution: 1:100 |
| Autoclavable surgical scissors | Any | Used for chopping specimens | |
| Cell strainers 40 µm | Corning | 431750 | Used during the second filtration |
| Cell strainers 70 µm | Corning | 431751 | Using during the first filtration |
| Collagenase, Type 2 | Worthington | LS004177 | Type 2 Collagenase used for enzymatic digestion. Working concentration: 2 mg/mL |
| Conjugated anti CD31 Antibody | BD Biosciences | 555445 | Used for cell sorting (1:20 dilution) |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) with CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Used for cell washing before medium change |
| Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline (PBS) without CaCl2 and MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Used for washing surgical specimens and cells before trypsinization |
| Endothelial Cell Growth Medium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC growth medium |
| Fibronectin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma used for plate coating. Working concentration: 50 µg/mL |
| Gelatin from porcine skin, type A | Sigma-Aldrich | G2500 | Used for plate coating |
| Type A gelatin | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatin from porcine skin used for plate coating. Working concentration: 1.5% |
References
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial cell. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 34 (12), 1508-1512 (2002).
- Lüscher, T. F., Tanner, F. C. Endothelial regulation of vascular tone and growth. American Journal of Hypertension. 6, 283-293 (1993).
- Marki, A., Esko, J. D., Pries, A. R., Ley, K. Role of the endothelial surface layer in neutrophil recruitment. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 503-515 (2015).
- Crampton, S. P., Davis, J., Hughes, C. C. W. Isolation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC). Journal of Visualized Experiments. (3), e183 (2007).
- Ganguly, A., Zhang, H., Sharma, R., Parsons, S., Patel, K. D. Isolation of human umbilical vein endothelial cells and their use in the study of neutrophil transmigration under flow conditions. Journal of Visualized Experiments. (66), e4032 (2012).
- Dejana, E., Corada, M., Lampugnani, M. G. Endothelial cell-to-cell junctions. FASEB Journal. 9 (10), 910-918 (1995).
- Plebani, R., et al. Establishment and long-term culture of human cystic fibrosis endothelial cells. Laboratory Investigation. 97 (11), 1375-1384 (2017).
- Totani, L., et al. Mechanisms of endothelial cell dysfunction in cystic fibrosis. Biochimica Et Biophysica Acta. Molecular Basis of Disease. 1863 (12), 3243-3253 (2017).
- Gaskill, C., Majka, S. M. A high-yield isolation and enrichment strategy for human lung microvascular endothelial cells. Pulmonary Circulation. 7 (1), 108-116 (2017).
- Hewett, P. W. Isolation and culture of human endothelial cells from micro- and macro-vessels. Methods in Molecular Biology. 1430, 61 (2016).
- van Beijnum, J. R., Rousch, M., Castermans, K., vander Linden, E., Griffioen, A. W. Isolation of endothelial cells from fresh tissues. Nature Protocols. 3 (6), 1085-1091 (2008).
- Comhair, S. A. A., et al. Human primary lung endothelial cells in culture. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 46 (6), 723-730 (2012).
- Visner, G. A., et al. Isolation and maintenance of human pulmonary artery endothelial cells in culture isolated from transplant donors. The American Journal of Physiology. 267, 406-413 (1994).
- Mackay, L. S., et al. Isolation and characterisation of human pulmonary microvascular endothelial cells from patients with severe emphysema. Respiratory Research. 14 (1), 23 (2013).
- Ventetuolo, C. E., et al. Culture of pulmonary artery endothelial cells from pulmonary artery catheter balloon tips: considerations for use in pulmonary vascular disease. The European Respiratory Journal. 55 (3), 1901313 (2020).
- Wang, J., Niu, N., Xu, S., Jin, Z. G. A simple protocol for isolating mouse lung endothelial cells. Scientific Reports. 9 (1), 1458 (2019).
- Wong, E., Nguyen, N., Hellman, J. Isolation of primary mouse lung endothelial cells. Journal of Visualized Experiments. (177), e63253 (2021).
- Kraan, J., et al. Endothelial CD276 (B7-H3) expression is increased in human malignancies and distinguishes between normal and tumour-derived circulating endothelial cells. British Journal of Cancer. 111 (1), 149-156 (2014).
- Khan, S. Y., et al. Premature senescence of endothelial cells upon chronic exposure to TNFα can be prevented by N-acetyl cysteine and plumericin. Scientific Reports. 7 (1), 39501 (2017).
- Cossarizza, A., et al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). European Journal of Immunology. 49 (10), 1457 (2019).
- Miron, R. J., Chai, J., Fujioka-Kobayashi, M., Sculean, A., Zhang, Y. Evaluation of 24 protocols for the production of platelet-rich fibrin. BMC Oral Health. 20 (1), 310 (2020).
- Lenting, P. J., Christophe, O. D., Denis, C. V. von Willebrand factor biosynthesis, secretion, and clearance: Connecting the far ends. Blood. 125 (13), 2019-2028 (2015).
- Thompson, S., Chesher, D. Lot-to-lot variation. The Clinical Biochemist Reviews. 39 (2), 51-60 (2018).
- Plebani, R., et al. Modeling pulmonary cystic fibrosis in a human lung airway-on-a-chip. Journal of Cystic Fibrosis. 21 (4), 606-615 (2021).
