中枢神经系统(CNS)肿瘤是儿童癌症相关死亡的主要原因,基于局部免疫的疗法越来越多地在临床试验中为患者进行测试。该协议描述了在小鼠中植入局部区域套管的方法,用于靶向CNS肿瘤的免疫治疗输注的临床前评估。
尽管化疗和放疗取得了进展,但儿科中枢神经系统肿瘤是导致大多数儿童癌症相关死亡的原因,并且预后不良。由于许多肿瘤缺乏有效的治疗方法,因此迫切需要开发更有前途的治疗方案,例如免疫疗法;使用嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法针对CNS肿瘤特别令人感兴趣。细胞表面靶标如B7-H3、IL13RA2和二脂离子苷GD2在几种儿童和成人中枢神经系统肿瘤的表面上高表达,增加了使用CAR-T细胞疗法对抗这些和其他表面靶标的机会。为了评估临床前小鼠模型中CAR-T细胞的重复局部区域递送,建立了一种留置导管系统,该系统概括了目前用于人体临床试验的留置导管。与立体定向给药不同,留置导管系统允许重复给药,而无需使用多次手术。该协议描述了固定引导套管的肿瘤内放置,该套管已用于在小儿脑肿瘤的原位鼠模型中成功测试连续CAR T细胞输注。在小鼠原位注射和植入肿瘤细胞后,在立体定向装置上完成固定引导套管的肿瘤内放置,并用螺钉和丙烯酸树脂固定。然后通过固定的引导套管插入治疗插管,以重复CAR-T细胞递送。可以调整引导套管的立体定向放置,以将CAR-T细胞直接输送到侧脑室或大脑的其他位置。该平台为CAR-T细胞的重复颅内输注和其他针对这些破坏性儿科肿瘤的新疗法的临床前测试提供了一种可靠的机制。
尽管化疗、放疗和手术有所改善,但中枢神经系统 (CNS) 肿瘤是儿科中最致命的恶性肿瘤1,这突显了对具有更成功结果的新方法的重要需求。随着免疫治疗领域的重大进展,过继细胞疗法(ACT)方法在各种癌症,尤其是血液系统恶性肿瘤中显示出有希望的结果2。嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法是一种特定类型的ACT,它利用免疫系统识别和杀死有害细胞的天然能力,通过重定向T细胞的特异性来产生肿瘤靶向T细胞3。CAR T细胞疗法在治疗白血病和淋巴瘤方面取得了巨大成功4,使其成为一种有前途的免疫治疗方法,并鼓励其在实体瘤中的研究。然而,到目前为止,CAR-T细胞治疗实体瘤的临床成功不大,面临肿瘤渗透效率低下、可靶向抗原有限、肿瘤微环境抑制等诸多挑战5。
最近的临床试验已经开始评估CAR T细胞疗法治疗儿科CNS肿瘤,在初步报告6,7,8中提供了T细胞活性的概念证明和早期证据。虽然大多数初始临床前数据都集中在CAR-T细胞的静脉内递送上,但最近的临床前证据表明,中枢神经系统9,10的局部区域递送具有优越性,该中枢神经系统也已成功用于多项临床试验6,7,8,11.迄今为止,纳入中枢神经系统中CAR-T细胞局部区域递送的临床前研究依赖于单次颅内剂量的CAR-T细胞立体定向递送9,10。然而,人体临床试验需要在CNS6,7,8,11中反复输注CAR-T细胞,这强调了在临床前开发中评估多次重复输注的必要性。该程序的目标是在小儿脑肿瘤的原位鼠模型中使用导管成功测试连续CAR-T细胞输注。该技术的优点是避免了多次外科手术来提供重复的CNS内治疗。插管主要用于神经递质的微透析取样和啮齿动物12的神经科学和行为研究中神经活性物质的递送,关于它们用于递送抗癌治疗剂的报道有限。在先前报告的基础上,该协议使用立体定向放置的留置套管系统在CNS肿瘤的异种移植小鼠模型中递送CAR T细胞。该协议可用于测试神经或神经肿瘤疾病的小鼠模型中的其他治疗方法,并且可能有助于测试绕过血脑屏障对疗效至关重要的新疗法。
CAR T细胞疗法彻底改变了血液系统癌症的治疗,并在治疗实体脑肿瘤方面显示出有希望的价值6,7,8。该方案旨在能够对用于治疗儿科CNS肿瘤的局部区域CAR-T细胞递送进行临床前评估。套管系统复制了Ommaya或Rickham储液器,这是一种脑室内导管系统,目前正在儿科CNS肿瘤6,7,8中进行CAR-T细胞治疗的临床试验,强调了这些方法的相关性和转化潜力。该系统允许重复递送绕过血脑屏障的CAR-T细胞,再次类似于正在进行的临床试验中采用的方法。局部区域递送可在中枢神经系统9中提供最大功效,还可以降低与循环贩运相关的全身毒性风险15。虽然立体定向给药可以向中枢神经系统提供单剂量,但该系统的优点是有机会将多个重复剂量提供到中枢神经系统的指定位置,而无需多次手术。该程序的局限性包括固定的分娩部位,一旦套管就位,就无法更改位置或进行调整,以及插管移位的可能性。
该协议中的一个关键步骤是在考虑到治疗套管的投影的D / V坐标处植入固定的引导套管。治疗套管将突出到引导套管的尖端之外,因此必须注意确保放置将导致CAR-T细胞递送到感兴趣的区域。治疗套管的投影长度可以定制,根据作者的经验,0.5毫米是一个有用的投影长度。该长度可确保治疗药物在分配时不会留在引导套管中,但也不需要将引导套管的D / V坐标显着调整到感兴趣的区域。该方案中的另一个重要步骤是在CAR-T细胞输注后将治疗套管留在原位的时间。输注结束后,治疗套管应保持至少1分钟,以防止CAR-T细胞治疗的泄漏和局部区域递送的损失。
排除此方法的故障很简单,大多数并发症涉及难以移除假套管或将治疗套管插入固定导引套管,可能是由于导引套管内部的干血。这可以通过轻轻地将假套管穿过导向套管,直到阻力较小并且碎片被清除来轻松解决。丙烯酸树脂偶尔会从头骨上脱落,导致套管系统的丧失。根据我们的经验,这通常受到用手术刀划伤头骨和放置两个螺钉的限制。此外,笼子中任何可能在鼠标四处移动时意外对套管施加力的物品都会被移除,例如带有小开口的特定小鼠浓缩小屋。
总之,这里描述的是用于在CNS肿瘤的小鼠模型中插入套管系统的方案,用于重复递送CAR-T细胞。插管位置可以调整到多个区域交付位置,测试不同交付地点的功效。此外,该系统可用于CAR-T细胞以外的其他治疗方法,以评估绕过血脑屏障时的疗效,并且还可用于评估非肿瘤性疾病小鼠模型中的治疗药物。
The authors have nothing to disclose.
这项工作的资金由Matthew Larson基金会,Grayson Save Foundation,Hyundai Hope on Wheels青年研究员奖,Kortney Rose基金会,美国国立卫生研究院NCI K12 CA076931-19和1K08CA263179-01以及国防部W81XWH-21-1-0221提供。
18 G needles | BD | 511097 | 1 1/2 inch metal hub |
Acrylic resin liquid | Lang Dental | B1323 | |
Acrylic resin powder | Lang Dental | B1323 | |
Alcohol wipes | BD | 326895 | |
Centrifuge 5240 | Eppendorf | 5420000040 | Centrifuge |
Cotton tipped swabs | Puritan | 826-WC | Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500) |
Drill bit holder | P1 Technologies | DH-1 | Drill bit holder for D56-D70 |
Drill bit | P1 Technologies | D58 | 1.07 mm |
Dummy cannula | P1 Technologies | C315DCS-5/SPC | Configuration: Small cap; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
Flat tip screwdriver | P1 Technologies | SD-80 | Screwdriver |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Forceps |
Guide cannula | P1 Technologies | C315GS-5/SPC | Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal |
Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine | Pascal | 1151602 | |
MOXI Z Mini automated cell counter Kit | Moxi | MXZ001 | Cell counter |
NOD scid gamma (NSG) mice | Jackson Laboratory | 5557 | 6 to 12-week-old males and females |
Pasteur pipet | VWR | 14673-043 | |
PKG tubing | P1 Technologies | C313CT | Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm |
Porcelain 12 well plate | Flinn Scientific | AP6064 | |
Povidone iodine | Medline | MDS093943 | |
Scalpel | World Precision Instrument | 50-822-457 | Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6" Ruler |
Screws | P1 Technologies | 0-80 X 3/32 | 2.4 mm |
Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 940 | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console |
Student fine scissors | Fine Science Tools | 91460-12 | Scissors |
Treatment cannula | P1 Technologies | C315IS-5/SPC | 33GA; Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
Treatment syringes | Hamilton | 87908 | 5 µL, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5"/PT3 |
Vactrap XL | Foxx Life Sciences | 305-4401-FLS | Vacuum System |