Centralnervesystemet (CNS) tumorer er den største årsag til kræftrelateret død hos børn, og lokoregionale immunbaserede terapier testes i stigende grad for patienter i kliniske forsøg. Denne protokol beskriver metoder til lokoregional kanyleimplantation hos mus til præklinisk evaluering af immunterapeutiske infusioner rettet mod CNS-tumorer.
Pædiatriske CNS-tumorer er ansvarlige for størstedelen af kræftrelaterede dødsfald hos børn og har dårlige prognoser på trods af fremskridt inden for kemoterapi og strålebehandling. Da mange tumorer mangler effektive behandlinger, er der et afgørende behov for at udvikle mere lovende terapeutiske muligheder, såsom immunterapier; brugen af kimær antigenreceptor (CAR) T-celleterapi rettet mod CNS-tumorer er af særlig interesse. Celleoverflademål såsom B7-H3, IL13RA2 og disialogangliosidet GD2 udtrykkes stærkt på overfladen af flere pædiatriske og voksne CNS-tumorer, hvilket øger muligheden for at anvende CAR T-celleterapi mod disse og andre overflademål. For at evaluere den gentagne lokoregionale levering af CAR T-celler i prækliniske murine modeller blev der etableret et indbygget katetersystem, der rekapitulerer indlagte katetre, der i øjeblikket anvendes i humane kliniske forsøg. I modsætning til stereotaktisk levering giver det indbyggede katetersystem mulighed for gentagen dosering uden brug af flere operationer. Denne protokol beskriver den intratumorale placering af en fast guidekanyle, der er blevet brugt til med succes at teste serielle CAR T-celleinfusioner i ortopiske murinmodeller af pædiatriske hjernetumorer. Efter ortopisk injektion og indkapsling af tumorcellerne hos mus afsluttes intratumoral placering af en fast styrekanyle på et stereotaktisk apparat og sikres med skruer og akrylharpiks. Behandlingskanyler indsættes derefter gennem den faste styrekanyle til gentagen CAR T-cellelevering. Stereotaktisk placering af styrekanylen kan justeres til at levere CAR T-celler direkte ind i lateral ventrikel eller andre steder i hjernen. Denne platform tilbyder en pålidelig mekanisme til præklinisk test af gentagne intrakranielle infusioner af CAR T-celler og andre nye lægemidler til disse ødelæggende pædiatriske tumorer.
På trods af forbedringer i kemoterapi, strålebehandling og kirurgi er tumorer i centralnervesystemet (CNS) den dødeligste malignitet i pædiatri1, hvilket understreger et vigtigt behov for nye tilgange med mere vellykkede resultater. Med betydelige fremskridt inden for immunterapi har adoptiv cellulær terapi (ACT) tilgange vist lovende resultater i forskellige kræftformer, især hæmatologiske maligniteter2. Chimeric antigen receptor (CAR) T-celleterapi, en bestemt type ACT, udnytter immunsystemets naturlige evne til at genkende og dræbe skadelige celler ved at omdirigere T-cellernes specificitet til at generere tumormålrettede T-celler3. CAR T-celleterapi har vist betydelig succes i behandlingen af leukæmier og lymfomer4, hvilket gør det til en lovende immunterapeutisk tilgang og tilskynder til undersøgelse i solide tumorer. Indtil videre har CAR T-celleterapi i solide tumorer imidlertid opnået ringe klinisk succes og står over for mange udfordringer, såsom ineffektiv tumorpenetration, begrænsede målbare antigener og det undertrykkende tumormikromiljø5.
Nylige kliniske forsøg er begyndt at evaluere CAR T-celleterapi til pædiatriske CNS-tumorer, hvilket giver bevis for koncept og tidlige beviser for T-celleaktivitet i foreløbige rapporter 6,7,8. Mens de fleste indledende prækliniske data fokuserede på intravenøs levering af CAR T-cellerne, har nylige prækliniske beviser antydet overlegenheden af lokoregional levering i CNS9,10, som også er blevet brugt med succes i flere kliniske forsøg 6,7,8,11 . Prækliniske undersøgelser til dato, der har inkorporeret den lokoregionale levering af CAR T-celler i CNS, har været afhængige af en enkelt intrakraniel dosis CAR T-celler leveret stereotaktisk 9,10. Imidlertid har kliniske forsøg med mennesker krævet gentagne infusioner af CAR T-celler i CNS 6,7,8,11, hvilket understreger et behov for at evaluere flere gentagne infusioner i præklinisk udvikling. Målet med denne procedure er at teste serielle CAR T-celleinfusioner ved hjælp af et kateter i ortopiske murinmodeller af pædiatriske hjernetumorer. Fordelen ved denne teknik er at undgå flere kirurgiske procedurer for at tilvejebringe gentagne intra-CNS-behandlinger. Kanyler er primært blevet brugt til mikrodialyseprøveudtagning af neurotransmittere og levering af neuroaktive stoffer i neurovidenskab og adfærdsforskning hos gnavere12, med begrænsede rapporter om deres anvendelse til levering af kræftbehandling. På baggrund af de tidligere rapporter bruger denne protokol et stereotaktisk placeret indbygget kanylesystem til at levere CAR T-celler i xenograft murine modeller af CNS-tumorer. Protokollen kan bruges til at teste yderligere terapi i murinmodeller af neurologiske eller neuro-onkologiske lidelser og kan være nyttig til at teste nye behandlinger, hvor omgåelse af blod-hjerne-barrieren er kritisk for effektiviteten.
CAR T-celleterapi har revolutioneret behandlingen af hæmatologiske kræftformer og viser lovende værdi i behandling af solide hjernetumorer 6,7,8. Denne protokol blev designet til at muliggøre præklinisk evaluering af lokoregional CAR T-cellelevering til behandling af pædiatriske CNS-tumorer. Kanylesystemet replikerer et Ommaya- eller Rickham-reservoir, et intraventrikulært katetersystem, der i øjeblikket anvendes i igangværende kliniske forsøg med CAR T-celleterapi i pædiatriske CNS-tumorer 6,7,8, hvilket understreger relevansen og translationspotentialet af disse metoder. Dette system giver mulighed for gentagen levering af CAR T-celler, der omgår blod-hjerne-barrieren, igen svarende til metoder, der anvendes i igangværende kliniske forsøg. Lokoregional levering kan give maksimal effektivitet i CNS9 og kan også reducere risikoen for systemiske toksiciteter forbundet med handel fra cirkulation15. Mens stereotaktisk levering kan give en enkelt dosis i CNS, er fordelen ved dette system muligheden for at tilvejebringe flere gentagne doser til et bestemt sted i CNS uden behov for flere operationer. Begrænsningerne ved denne procedure omfatter et fast leveringssted uden mulighed for at ændre placering eller foretage justeringer, når kanylen er på plads, og potentialet for løsrivelse af kanylen.
Et kritisk trin i denne protokol er implantationen af den faste styrekanyle ved en D / V-koordinat, der tager højde for projektionen af behandlingskanylerne. Behandlingskanylen stikker ud over spidsen af styrekanylen, og derfor skal man sørge for, at placeringen resulterer i levering af CAR T-celler til det pågældende område. Projektionslængder af behandlingskanylen kan tilpasses, og efter forfatterens erfaring er 0,5 mm en nyttig projektionslængde. Denne længde sikrer, at det terapeutiske ikke forbliver i styrekanylen ved udlevering, men kræver heller ikke væsentlig justering af D / V-koordinaterne for styrekanylen til det relevante område. Et yderligere vigtigt skridt i denne protokol er det tidspunkt, hvor behandlingskanylen efterlades på plads efter CAR T-celleinfusion. Behandlingskanylen skal holdes på plads i mindst 1 minut efter afslutningen af infusionen for at forhindre lækager og tab af lokoregional levering af CAR T-celleterapi.
Fejlfinding af denne metode er ligetil, idet de fleste komplikationer involverer vanskeligheder med at fjerne dummykanylen eller indsætte behandlingskanylen i den faste styrekanyle, sandsynligvis på grund af tørret blod på indersiden af styrekanylen. Dette kan let løses ved forsigtigt at føre dummykanylen gennem styrekanylen, indtil der er mindre modstand, og snavset er blevet ryddet. Akrylharpiksen kan lejlighedsvis løsne sig fra kraniet, hvilket resulterer i tab af kanylesystemet. Efter vores erfaring er dette generelt begrænset ved at score kraniet med en skalpel og placeringen af to skruer. Derudover fjernes alle genstande fra buret, der ved et uheld kan anvende kraft på kanylen, mens musen bevæger sig rundt, såsom særlige museberigelseshytter med små åbninger.
Afslutningsvis er beskrevet her en protokol til indsættelse af et kanylesystem i murinmodeller af CNS-tumorer til gentagen levering af CAR T-celler. Kanyleplacering kan justeres til flere lokoregionale leveringssteder og teste effektiviteten af forskellige leveringssteder. Derudover kan dette system bruges til yderligere terapi ud over CAR T-celler for at evaluere effektiviteten ved omgåelse af blod-hjerne-barrieren og kan også være nyttigt til evaluering af terapi i murinmodeller af ikke-onkologiske lidelser.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering til dette arbejde blev leveret af Matthew Larson Foundation, Grayson Saves Foundation, Hyundai Hope on Wheels Young Investigator Award, Kortney Rose Foundation, National Institutes of Health NCI K12 CA076931-19 og 1K08CA263179-01 og Department of Defense W81XWH-21-1-0221.
18 G needles | BD | 511097 | 1 1/2 inch metal hub |
Acrylic resin liquid | Lang Dental | B1323 | |
Acrylic resin powder | Lang Dental | B1323 | |
Alcohol wipes | BD | 326895 | |
Centrifuge 5240 | Eppendorf | 5420000040 | Centrifuge |
Cotton tipped swabs | Puritan | 826-WC | Handle Width = 2.11 mm (0.083), Head Width = 1.27 mm (0.050), Handle Length = 147.62 mm (5.812), Overall Length = 152.4 mm (6), Head Length = 12.7 mm (0.500) |
Drill bit holder | P1 Technologies | DH-1 | Drill bit holder for D56-D70 |
Drill bit | P1 Technologies | D58 | 1.07 mm |
Dummy cannula | P1 Technologies | C315DCS-5/SPC | Configuration: Small cap; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
Flat tip screwdriver | P1 Technologies | SD-80 | Screwdriver |
Graefe forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | Forceps |
Guide cannula | P1 Technologies | C315GS-5/SPC | Configuration: 5.00 mm pedestal height; Length: Cut 5.00 mm below pedestal |
Hemostatic cotton pellets with racemic epinephrine | Pascal | 1151602 | |
MOXI Z Mini automated cell counter Kit | Moxi | MXZ001 | Cell counter |
NOD scid gamma (NSG) mice | Jackson Laboratory | 5557 | 6 to 12-week-old males and females |
Pasteur pipet | VWR | 14673-043 | |
PKG tubing | P1 Technologies | C313CT | Diameter: 0.58 mm x 1.27 mm |
Porcelain 12 well plate | Flinn Scientific | AP6064 | |
Povidone iodine | Medline | MDS093943 | |
Scalpel | World Precision Instrument | 50-822-457 | Disposable Scalpel, no.10, sterile, 10/box, Plastic Handle with 6" Ruler |
Screws | P1 Technologies | 0-80 X 3/32 | 2.4 mm |
Stereotaxic Frame | David Kopf Instruments | 940 | Model 940 Small Animal Stereotaxic Instrument with Digital Display Console |
Student fine scissors | Fine Science Tools | 91460-12 | Scissors |
Treatment cannula | P1 Technologies | C315IS-5/SPC | 33GA; Configuration: Standard internal; Length: Cut 5.00 mm below pedestal; Projection: 0.50 mm |
Treatment syringes | Hamilton | 87908 | 5 µL, Model 75 Cemented Needle Special (SN) Syringe, 75SN/22/0.5"/PT3 |
Vactrap XL | Foxx Life Sciences | 305-4401-FLS | Vacuum System |