L'attuale studio descrive un protocollo per monitorare i cambiamenti nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) durante l'infezione virale utilizzando un sistema di analisi cellulare in tempo reale (RTCA).
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Articolo metodologico
Monitoraggio dei cambiamenti nelle cellule endoteliali della vena ombelicale umana in seguito a infezione virale utilizzando l'analisi cellulare in tempo reale basata sull'impedenza
In questo articolo
Sommario
Abstract
Le cellule endoteliali rivestono la superficie interna di tutti i vasi sanguigni e linfatici, creando una barriera semipermeabile che regola lo scambio di fluidi e soluti tra il sangue o la linfa e i tessuti circostanti. La capacità di un virus di attraversare la barriera endoteliale è un meccanismo importante che facilita la diffusione del virus nel corpo umano. Molti virus alterano la permeabilità endoteliale e/o causano l'interruzione della barriera cellulare endoteliale durante l'infezione, che è in grado di causare perdite vascolari. L'attuale studio descrive un protocollo di analisi cellulare in tempo reale (RTCA), utilizzando un analizzatore cellulare in tempo reale commerciale per monitorare l'integrità endoteliale e i cambiamenti di permeabilità durante l'infezione da virus Zika (ZIKV) delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC). I segnali di impedenza registrati prima e dopo l'infezione da ZIKV sono stati tradotti in valori di indice cellulare (CI) e analizzati. Il protocollo RTCA consente di rilevare effetti transitori sotto forma di cambiamenti morfologici cellulari durante un'infezione virale. Questo saggio potrebbe anche essere utile per studiare i cambiamenti nell'integrità vascolare degli HUVEC in altre configurazioni sperimentali.
Introduzione
Le cellule endoteliali (EC) rivestono la superficie interna di tutti i vasi sanguigni e linfatici. Sono collegati da aderenti, giunzioni a fessura stretta, che creano una barriera semipermeabile tra il sangue o la linfa e i tessuti circostanti 1,2. Le giunzioni endoteliali intatte cellula-cellula sono fondamentali per regolare il trasporto di macromolecole, soluti e fluidi, cruciali per le attività fisiologiche dei tessuti e degli organi corrispondenti3. La barriera endoteliale è dinamica e modulata da stimoli specifici4. L'interruzione o la perdita della funzion....
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Protocollo
1. Preparazione delle cellule
- Preparazione di HUVEC
- Coltivare 7,5 x 105 cellule HUVEC/mL in un matraccio di coltura cellulare da 75cm2 (rivestito con 20 μg/mL di collagene di tipo 1) contenente 12 mL di terreno endoteliale (ECM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), 0,01% di integratore per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS) che contiene fattori di crescita, ormoni e proteine necessari per la coltura di HUVEC, e 0,01% penicillina-streptomicina (P/S). Incubare le cellule in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con il 5% di CO2 (Figura 1). ....
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Risultati
Prima dell'infezione da ZIKV, l'IC registrato per il monostrato HUVEC coltivato su una piastra microtitolante rivestita con microelettrodo in oro era superiore a 8, suggerendo forti proprietà di aderenza. Le piastre o i pozzetti con un indice CI inferiore a 8 devono essere scartati. Gli HUVEC sono stati quindi infettati con ZIKV a un MOI di 0,1 e 1 e l'impedenza cellulare è stata registrata per 7 giorni. Il valore di CI degli HUVEC infettati con ZIKV P6-740 a un MOI di 0,1 (linea azzurra) ha iniziato a scendere a 15 ore .......
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Discussione
L'infezione virale citocida nelle cellule permissive è solitamente associata a cambiamenti sostanziali nella morfologia e nella biosintesi cellulare36. I cambiamenti morfologici cellulari indotti dal virus, come il restringimento cellulare, l'allargamento cellulare e/o la formazione di sincizi, sono anche noti come effetti citopatici (CPE), caratteristici di alcune infezioni virali37. Nelle EC, la CPE è stata descritta come la distruzione delle cellule e la rottura delle gi.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Ringraziamenti
Questa ricerca ha ricevuto il sostegno del Ministero dell'Istruzione Superiore della Malesia nell'ambito del programma Higher Institution Centre of Excellence (HICoE) (MO002-2019) e il finanziamento nell'ambito del Long-Term Research Grant Scheme (LRGS MRUN Phase 1: LRGS MRUN/F1/01/2018).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provetta per microcentrifuga da 1,5 mL | Nest | 615601 | |
| 37 gradi Incubatore C con 5% CO2 | Sanyo | MCO-18AIC | |
| 75 cm2 pallone per coltura tissutale | Corning | 430725U | |
| Soluzione antibiotica penicillina-streptomicina (P/S) | Sciencell | 0503 | |
| Cabina di sicurezza biologica, Classe II | Holten | HB2448 | |
| Collagene di tipo 1 | SIgma-Aldrich | C3867 | |
| Integratore per la crescita delle cellule endoteliali (ECGS) | Sciencell | 1052 | |
| Terreno cellulare endoteliale (ECM) | Sciencell | 1001 | |
| Piastra elettronica 96 | Agilent Technologies, Inc. | ||
| Siero fetale bovino (FBS) | Sciencell | 0025 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) | Emocitometro Sigma-Aldrich | H9394 | |
| Laboroptik LTD | Neubauer improved | ||
| Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) | Sciencell | 8000 | |
| Microscopio invertito | ZEISS | Computer portatile TELAVAL 31 | |
| Latitude 3520 | Dell | - | |
| Micropipetta multicanale (10 - 100 µ L) | Eppendorf | 3125000036 | |
| Micropipetta multicanale (30 - 300 &; L) | Eppendorf | 3125000052 | |
| Riserva reagenti | Tarsons | T38-524090 | |
| Piastra resistiva RTCA 96 | Agilent Technologies, Inc. | ||
| RTCA Software Pro (versione 2.6.1) | Agilent Technologies, Inc. | ||
| Pipette monocanale (10 - 100 &; micro; L) | Eppendorf | 3123000047 | |
| Pipette monocanale (100 - 1000 &; micro; L) | Eppendorf | 3123000063 | |
| Pipette monocanale (20 - 200 &; micro; L) | Eppendorf | 3123000055 | |
| xCELLigence Analizzatore di cellule in tempo reale SP (Modello: W380) | Agilent Technologies, Inc. | 00380601030 | https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-analysis/rtca-analyzers/xcelligence-rtca-sp-single-plate-741232 |
Riferimenti
- Alberts, B., et al. Cell junctions. Molecular Biology of the Cell. 4th Edition. , Garland Science. (2002).
- Pugsley, M. K., Tabrizchi, R. The vascular system: An overview of structure and function. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 44 (2), 333-34....
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Ristampe e permessi
